材料和试剂

定制的用于细菌液体培养的Pyrex玻璃管（200×32mm，由Pyrex管，Corning制造，目录号：8510-32-D）
注意：可以从 http：// www.degroot.co.il /
“海绵塞”（塑料泡沫塞，27 x 34毫米）（Jaece Industies，目录号：L800-C）
巴斯德移液器（230毫米）（Romical，目录号：94-08401002）
0.45μm注射器过滤器（Sartorius，目录号：16555）
过滤器Stericup-GP 250 ml Express Plus PES（0.22μm）（EMD Millpore，目录号：SCGPU05RE）
硅胶管（6×9mm，4×6mm）（Degania Silicone，目录号：2110600234,2110400434）
无菌移液器1和25 ml
1 ml移液器（Corning，Costar ^{®，目录号：4011）
25毫升移液器（康宁，Costar ^{®，目录号：4489）}}
灭菌移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：T-200-C，T-1000-C）}
Eppendorf管（1.5ml）（Corning，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
细胞聚球细胞PCC7942
硝酸钠（NaNO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S8170）
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Merck，目录号：K26364082）
注意：本产品已停产。或者，可以使用默克，目录号：105886。
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（ICN，目录号：10035-04-8）
注意：本产品已停产。或者，可以使用Bio-Lab，目录号：034205。
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）（Honeywell International，Riedel-de-Haen，目录号：04248）
乙二胺四乙酸（Na 2 Mg·EDTA）（Bio-Lab，目录号：05142359）
注意：本产品已停产。或者，可以使用Biosolve，目录号：051423。
柠檬酸铁铵（C 6 H 11 11 FeNO 7）（MP Biomedicals，目录号：02158040）
柠檬酸（C 6 H 8 O 7）（Frutarom，目录号：2355511000）
注意：本产品已停产。或者，可以使用Biosolve，目录号：030205。
硼酸（H 3 O 3 BO 3）（Bio-Lab，目录号：02010591）
注意：本产品已停产。或者，可以使用Biosolve，目录号：020105。
六水合氯化锰（MnCl 2·6H 2 O）（Duchefa Biochemie，目录号：M0533）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（CARLO ERBA试剂，目录号：494907）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（MP Biomedicals，目录号：194863）
五水硫酸铜（CuSO 4·5H 2 O）（Honeywell International，Riedel-de-Haen，目录号：12849）
硝酸钴（II）六水合物（Co（NO 3 3）2·6H 2 O）（Honeywell International，Riedel-de-Haen，catalog号码：12922）
注意：本产品已停产。或者，可以使用Sigma-Aldrich，目录号：239267。
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氢氧化钠（NaOH）（Frutarom，目录号：5553510）
丙酮（（CH 3 3）2 CO），A.C.S.试剂（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ^{，目录号：9006-03）}
碳酸氢钠（NaHCO 3）（DAEJUNG CHEMICAL＆amp; METALS，目录号：7566-4100）
硫代硫酸钠（Na 2 S 2 O 3 O 3）（Sigma-Aldrich，目录号：217247）
Bacto琼脂（BD，Bacto ^{TM，目录号：214010）}
LB琼脂（Lennox）（BD，Difco ^{TM，目录号：240110）}
抗生素（根据特定菌株的耐药性适当添加）
1. 倍他霉素二盐酸盐五水合物（Duchefa Biochemie，目录号：S0188）
2. 硫酸卡那霉素一水合物（Duchefa Biochemie，目录号：K0126）
3. 硫酸庆大霉素（Duchefa Biochemie，目录号：G0124）
4. 氯霉素（Duchefa Biochemie，目录号：C0113）
液体BG11-介质（参见食谱）
1. 库存我（100倍集中）
2. 股票II（100倍集中）
3. 股票III（100倍集中）
4. 股票V（1,000倍集中）
固体BG11-培养基（参见食谱）

设备

层流罩
通风柜
高压灭菌器
分光光度计（Agilent Technologies，型号：Cary 100，目录号：10069000）和各自的比色杯（细胞类型P.L = 10mm / EA）（Starna Cells，目录号：9-SOG-10）
台式离心机（MiniSpin，最大离心力：12,100×g）（Eppendorf，型号：MiniSpin，目录号：5452000018）
冰箱（4-7°C）
生长室（液体培养物分别为30±2℃和24±2℃，分别在固体培养基上培养）注意：在24°C而不是30°C的固体培养基上培养培养物可以使文化保持更长时间。
光源
对于液体培养物 - 产生20-30μmol光子的光通量的白炽灯m ^{sec ^{-1 ;固体BG11上的培养物用荧光灯照射（5μmol光子m ^{-2 ^{sec ^{-1 ）}}}}}
吸管
单通道移液器200和1,000μl
鼓泡系统
1. 空气压缩机（无油空气压缩机）（Assouline压缩机，型号：vs 204 50）
2. 气瓶二氧化碳（CO 2％，化合物99.5％）（Maxima，目录号：GCDCU2.527）
3. 流量计（Tuttnauer公司，0-0.1L / min，1-10L / min）
4. 高流量气压调节器（0-2 PSI）（Marsh Bellofram，型号70，型号：960-129-000）
注意：要使用3％CO _{2 在空气中鼓泡文化，使用以下设置（图1）：CO 在空气中。通过在2L瓶中鼓泡入1.5L双蒸水（DDW）将该混合物加湿，以防止在培养物鼓泡期间水分蒸发。该瓶子的出口通过一个空的2升瓶（用于捕集残留液体），并通过空气压力调节器（200毫巴适用于〜300培养管的鼓泡）。使用由硅胶管和合适的T形棒连接器构成的自制歧管，将富集空气从后者进入多种文化的CO 。每个歧管通道中的气体通过0.45μm过滤器（图1）。提供了一个简短的视频来演示各个培养管中的流速（视频1）。

图1.描述用CO气泡培养的设置的方案 2 <空>

Video 1. Cyanobacterial cultures under bubbling}

程序

生长细胞聚球细胞PCC 7942及其生物膜形成突变体的液体培养物

圆底Pyrex管（长20厘米，直径3厘米）用作生长血管。
将一根棉塞巴斯德吸管（23厘米长）插入海绵塞中，使得巴斯德吸管的尖端位于管底部1-2厘米处（图2A，“生长组”）。
生长组在液体循环中进行高压灭菌
将无菌液体BG11-培养基（25-50ml）（参见食谱）转移到Pyrex管中。将培养体积调整为指定实验所需的生物量。
细胞用固体BG11培养基（参见食谱）用1毫升无菌塑料移液器刮擦，生物质在液体培养基中摇动（见附注4）。
重要提示：。高压灭菌BG11应在4天内用于接种培养物。
通过1毫升移液器吸头连接生长系统到冒泡系统（见上文）（图2A）
使用歧管允许同时鼓泡多种培养物（图2B，参见设备下的注释）。

图2.生长的蓝藻培养物。：一种。生长组合连接到单个歧管通道; B.成长室中的文化。

生物膜的定量

在连续照射下，在连续照射下，在白炽灯（20-30μmol光子），在30℃下在空气中连续鼓泡3％CO 2 / -1 ）。
指数阶段的起始培养物经稀释（通常在3天生长后）至750nm处的光密度为0.5。
通过将培养物的另外稀释开始于750nm的光密度为0.5（参见附注5）。
此设置下的生物膜开发通常在2-3天后开始。
为了验证培养物是否为固体LB琼脂上的20μl等分试样的“斑点”。
悬浮细胞中叶绿素的百分比用于定量生物膜形成如下（图3）：

在1.5ml Eppendorf管中进行浮游细胞中叶绿素的提取。从悬浮培养物的上部取出等分试样（见附注6）。在悬浮部分看起来特别密集（浮游菌株或不良生物膜形成物）的情况下，使用0.2ml样品进行提取。当形成坚固的生物膜时，在80％丙酮（最终浓度）中叶绿素提取之前，通过离心（5,000×g，10分钟）除去15ml浮游细胞并浓缩3至6倍。
生物膜中叶绿素的提取在生长管中进行。为了分离生物膜部分，缓慢除去悬浮细胞。生物膜倾向于在去除最后几毫升液体期间塌陷。因此，一旦生物膜结块分解并落入液体，就停止去除培养物。使用移液管（在我们手中留下2-5毫升）以及从培养物中取出的体积测量管中残留的体积。这些体积的总和（V _{total ）用于计算悬浮细胞中叶绿素的量（参见数据分析）。在80％丙酮中进行叶绿素的提取，其最终体积等于V总计。}
叶绿素的提取在冰箱中进行过夜，叶绿素根据先前描述的吸光度进行定量（Arnon，1949; Ritchie，2006）。叶绿素可用甲醇代替丙酮萃取。 Zavřel等人（2015）描述了用于测量蓝细菌中叶绿素a浓度的逐步方案。

图3.基于叶绿素测量的生物膜的定量

数据分析

悬浮液中叶绿素的百分比由浮游生物膜和生物膜组分中的叶绿素含量计算。这些值是根据测量的叶绿素吸光度，样品体积和稀释因子计算的，如下所述。表1中提供了一个示例计算。

表1.浮游生物膜细胞中叶绿素（Chl）的计算示例

根据测定的叶绿素浓度和悬浮培养物的体积计算悬浮细胞中叶绿素的含量（V ）。
总Chl浮游生物（μg）=（OD 663 - OD 750）×12.7×（稀释因子）×V
根据测定的叶绿素浓度和丙酮提取的体积计算生物膜中叶绿素的含量，该浓度应为V 。

如果观察到健壮的生物膜形成，则生物膜部分中剩余的浮游细胞的贡献可忽略不计，总叶绿素计算如下：

总Chl生物膜（μg）=（OD 663 750）×12.7×（稀释因子）×V
为了解释生物膜部分中剩余的浮游细胞的贡献，从以上值减去部分体积中存在的浮游叶绿素：

总Chl生物膜校正（μg）=（生物膜中的Ch1浓度）x V总计 - （浮游生物中的Chl浓度）x（分离生物膜的体积）

培养中总叶绿素是浮游细胞和生物膜中叶绿素含量的总和。

总Chl（μg）=总Chl生物膜+总Chl浮游生物

或

总Chl（μg）=总Chl生物膜修正+总Chl浮游生物
生物膜形成的程度以浮游细胞中叶绿素的百分比表示。

悬浮液中的Chl（％）=（总Chl浮游生物）/（总Chl）×100％

笔记

所有使用蓝藻培养的工作都是在无菌条件下使用层流罩进行的。
海绵塞用锥子冲压。
为了冒泡少量的培养物，可以使用迷你水族馆泵（例如，例如JBL ProAir a50，Art.No.6054600）代替压缩机。作为混合空气和CO 2的替代方案可以购买3％CO 2气瓶。
以前的研究表明，生物膜抑制物质存在于野生型培养物以及生物膜形成突变体T2SEΩ（Schatz等人，2013）的旧培养物的细胞外液中。为了避免在生物膜形成突变体的培养物中可能的抑制剂积累，通过接种从固体琼脂生长的细胞来启动培养物。确保稀释这些起始培养物的“生物膜定量测定”，而在生长的指数阶段。
起始培养物从在固体琼脂上生长的培养物接种。由于接种物的变化，所得液体培养物的细胞密度变化。稀释步骤对于确保在相同密度和类似生理状态下开始实验是重要的。
首先，从悬浮培养物的上部取出等分试样，然后除去其余的悬浮液，以避免用生物膜细胞污染提取等分试样。

食谱

液体BG11-介质（基于Stanier等人，1971）

库存I，100x浓缩（高压釜）
150.00g / L NaNO 3
6.50g / L MgSO 4·7H 2 O
3.60g / L CaCl 2·2H 2 O ○
库存二，100倍浓缩（高压釜）
3.05g / L K 2 HPO 4
0.10g / L Na 2 Mg·EDTA
库存III，100x浓缩（准备新鲜，不需要消毒）
0.60g / L C 6 H 11 11 FeNO 7
0.60g / L C 6 H 8 O 7
库存V，1,000倍浓缩（使用Filter Stericup过滤灭菌[0.22μm]）
2.86g / L H 3 3＆lt; 3＆lt; 3＆gt;
1.84g / L MnCl 2·4H 2 O
0.22g / L ZnSO 4·7H 2 O
0.39g / L NaMoO 4·2H 2 O 0.08g / L CuSO 4·5H 2 O
0.05g / L Co（NO 3 3）2·6H 2 O
用10N NaOH（399.97g / L）（高压釜）滴定至119℃的HEPES 119.15g / L（浓缩25倍）。
1L液体BG11的制备：
从约500ml DDW开始，从原液中加入所需体积，并加入DDW至1L。溶液用高压灭菌灭菌（灭菌时间：40分钟）。一旦循环结束，立即从高压釜中取出（长时间暴露于高温可能会影响矿物的沉淀）。不要多次高压灭菌介质。将培养基等分成生长管之前混合注意：为了可重复地观察生物膜形成，每当制备液体BG11时，使用新鲜的原料III是至关重要的。高压釜BG11储存在室温下。培养基应在4天内用于接种培养物。

固体BG11-介质

液体BG11的库存解决方案
碳酸氢钠42g / L（100x浓缩）
硫代硫酸钠470 g / L（100x浓缩）
通过从储备溶液
稀释适量的液体，制备双重浓缩液BG11（BG11X2）
在DDW中准备3％Bacto琼脂
将BG11X2和3％琼脂高压釜放置在不同的容器中
灭菌后立即加入等量的BG11X2和3％琼脂，以获得BG11中的1.5％琼脂。
冷却至〜50-55℃，稀释100倍NaHCO 3和Na 2 S 2 O 3 O 3 /储备溶液（在这一步可以添加抗生素）：
望角霉素二盐酸盐五水合物（终浓度：50μg/ ml）
硫酸卡那霉素一水合物（终浓度：50μg/ ml）
硫酸庆大霉素（终浓度：7.5μg/ ml）
氯霉素（终浓度：7.5μg/ ml）
将90毫升培养皿倒入50毫升

致谢

该协议是从以前的研究（Schatz等人，2013; Parnasa等人，2016）修改的。生长培养基基于（Stanier等人，1971）的方案。叶绿素测量基于以前的方案（Arnon，1949; Ritchie，2006）。 Rakefet Schwarz和Susan Golden由美国国家科学基金会和美国 - 以色列两岸科学基金会（NSF-BSF 2012823）的计划提供支持。这项研究也得到以色列科学基金会（ISF 1406/14）给Rakefet Schwarz的资助。

参考

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