材料和试剂

注意：对于蚊子的饲养和蚊子殖民地的一般维护，参见Bio-protocol Kauffman等人（2017）。

棉针织棉签，15厘米手柄（清教徒，目录号：25-826 5WC）
培养皿，无菌，60mm（例如，60mm TC处理的细胞培养皿，Corning，Falcon，目录号：353002）
塑料包装
50ml锥形离心管（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229422）
15毫升锥形离心管（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229412）
5 ml管，12 x 75 mm（Corning，Falcon ^{®，目录号：352054）}
96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：15041）}
5 ml血清移液管（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229206B）
10 ml血清移液管（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229211B）
微量离心管，1.5ml（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
针头：30尺，小RN轮毂，定制，点式4（10°-12°斜面），25毫米长度（汉密尔顿，目录号：7803-07）
注意：替代针头：使用一次性皮下注射针，例如30 G x 1英寸（BD，目录号：305128）。
25 x 75 x 1.0 mm的磨砂显微镜载玻片（例如，Fisher Scientific，目录号：12-550-343）
木制施药棒，15厘米（清教徒，目录号：807）
昆虫针头Morpho Black搪瓷No.000（BioQuip，目录号：1208B000）
用木制的涂抹棒和昆虫针制成的探针探针注意：解剖探针由15厘米的木制施药器和昆虫针制成。将涂抹棒浸泡在热水中至少30分钟，并将头部从针脚上切下并丢弃。使用洗涤器，握住针脚，避免损坏尖端，并将钝头（切割）端部推入棒中。让探针干燥。
转移移液管，1毫升，散装，无毒（BioLogix，目录号：30-0135）
pH测试条（例如，Sigma-Aldrich，目录号：P4536-100EA）
女性蚊子
蚊子手提箱（参见Bio-protocol Kauffman等人，2017，用于描述和建造）
小鼠
三乙胺（Sigma-Aldrich，目录号：T0866）
乙醇
磷酸盐缓冲盐水（PBS），低内毒素≤0.25EU/ ml（即Mediatech，目录号：21-030-CV）
微量BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：23235）}
端点显色鲎Amebocyte裂解液QCL-1000测定（Lonza，目录号：50-647U）
消毒剂，如漂白剂或Umonium ^{38（Huckert's Laboratoire International，目录号：PF 12209）}
异氟烷，Iso-Vet（Chanelle，目录号：CDS019936）用于麻醉小鼠
70％乙醇：将74ml乙醇与26ml水混合。标记为易燃并在室温下储存长达3个月
Alexa Fluor 680
单克隆抗体4G2

设备

搅拌棒和搅拌棒
浮动微管架（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：5974-4015）}
镊子，超细窍门，瑞士风格＃5（BioQuip，目录号：4535）
盖滑镊子（Fisher Scientific，目录号：S17328C）
制造商：Medco Instruments，目录号：S17328C。
注意：镊子的平坦部分在整个表面上彼此接触很重要。如果相对的表面仅接触一点，则在插入针时，耳廓皮肤更有可能产生褶皱。
立体放大显微镜（例如，尼康仪器，型号：SMZ1500）
Branson Sonifier 450型（Branson 450模拟超声波器，1/2“喇叭，400 W，120 VAC）（Cole-Parmer，目录号：EW-04715-03）
制造商：Emerson Electric，BRANSON，型号：Model 450。
用于超音波处理器的杯形喇叭，3“直径（Cole-Parmer，目录号：EW-04715-39）
制造商：Emerson Electric，BRANSON，目录号：109-116-1760。
Branson防爆外壳超声波处理器（Cole-Parmer，目录号：EW-04715-44）
制造商：Emerson Electric，BRANSON，目录号：101-063-275。
冷冻离心机（例如，Eppendorf，型号：5417R）
可重复使用的玻璃显微注射器型号702RN，无针，体积25μl（Hamilton，目录号：7636-01）
注意：替代注射器：可重复使用的玻璃显微注射器型号702 LT（Luer tip），SYR，NDL单独出售，无针，体积25μl（Hamilton，目录号：80401）。
能够加热到37℃和60℃的热块（例如，数字干块加热器，单块240V，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：88870004）}
能够读取562nm和405-410nm吸收的读板器，以及能够加热到37℃的温度控制（例如，BioTek Instruments，型号：ELx808）

程序

女性唾液腺的解剖（图1）

图1.伊蚊的图示显示唾液腺的位置的蚊子
1. 通过将蚊子沾上三乙胺的棉签放在蚊帐的网眼盖上来麻醉蚊子;用塑料包装或培养皿盖住三乙胺（图2）
  
  图2.用于麻醉蚊子的蚊子夹持
2. 一旦蚊子被麻醉，将它们转移到培养皿和盖子上。使用超细尖端镊子从盘中取出雌性，并浸入含70％乙醇的微量离心管中以对体表进行灭菌（图3）。
  
  图3.唾液腺去除工具
3. 使用转移移液管在显微镜载玻片上放一滴（约50μl）的PBS，并将其滴落
4. 将幻灯片放置在解剖显微镜的舞台上。
5. 取出蚊子的腿，然后将身体放在PBS的侧面（见视频1）。
  
  Video 1. Dissection of mosquito salivary glands
6. 从解剖探头上切开腹部，取出腹部尖端;不要拉。
7. 将一个解剖探头放在蚊子的胸部，另一头在头部和胸部之间。对胸部施加温和的压力，然后轻轻地从胸部拉出头部（图4和视频1）。
  
  图4.蚊子图：唾液腺移除定位
8. 如果唾液腺保持头部，并且可以用探头将其抬起并离开头部，同时在腺体和头部之间握住一个探针（图5A和视频1）可以清除唾液腺。如果腺体保留在胸腔内，应用温和的压力将一个探头平放在胸部上，并使用另一个探头定位并轻轻挑出腺体（图5B和视频1）。
  
  图5.蚊子图：去除唾液腺。 A.将唾液腺升起＆amp;远离头B.从胸部抽出唾液腺。
9. 一旦取出腺体后，将另外两滴新鲜PBS分别放在载玻片上，但不接触初始液滴，并通过PBS液滴依次绘制，仔细冲洗腺体（图6）。
  
  图6.清除后冲洗唾液腺
10. 将一对唾液腺置于10μlPBS中，最多放入50对，体积为500μl。
  因为蚊子接种体积<在探查血管时为5μl，可以选择以较高浓度（使用较低体积的PBS）制备SGE，以便以后能够减少皮内接种的体积。
11. 储存于-20°C，直至准备好SGE。
SGE的准备
1. 去除冷冻的腺体并在37°C迅速解冻。
2. 将水和冰芯片添加到超声波仪器的喇叭。
3. 将含有唾液腺的微量离心管放入浮动微管架中。
4. 使用以下参数对超声波仪器进行编程：100 mV，3秒20秒，突发之间1分钟冷却。
5. 在4℃下以5,000×g离心10分钟。
6. 将上清液移至新鲜的微量离心管。
7. 按照制造商的微孔板程序，使用Micro BCA Protein Assay Kit确定SGE的蛋白质浓度。每一对唾液腺获得的蛋白质的典型量为0.8-1.2μg，我们以10μlPBS的体积获得。
8. 使用pH条测试SGE储备液的pH值，由于PBS的缓冲能力，其应为中性pH 7.0。在pH不是中性的情况下，数据的解释应该考虑到这一点。一方面，pH可能是来自所用载体物种的唾液的固有特性。另一方面，pH的差异可能改变实验中使用的病毒或其他病原体的感染性和传播。
9. 确认SGE库存没有内毒素，或含有非常低的水平，远低于FDA批准的注射液限制（<5内毒素单位/ kg /小时），如使用终点显色鲎Amebocyte裂解液试剂盒（Lonza）测试的，和10μlSGE原料，其对应于约1μg蛋白质。如果内毒素水平高，则应该丢弃SGE制剂，因为观察到的效果不能清楚地归因于SGE的组分或内毒素的存在。
10. 储存于-80°C。
皮内接种
1. 在无菌PBS中的1.5ml管中稀释 SGE。调整浓度，每20μlPBS含有0.2至1个唾液腺（每只蚊子有一对唾液腺）的提取物。如果测试SGE对蛛网膜病毒感染的影响，则将SGE与浓缩的病毒储备物例如混合，将DENV（10μg/ ml）参见[Schmid和Harris，2014; Schmid等人，2016]）。使用在PBS中稀释的病毒作为无蚊子唾液的对照。作为进一步的对照，使用非注射（未触动）耳朵或单独的PBS的皮内接种。
  如果病毒和SGE储备溶液的滴度足够高，则接种总体积小于20μl可能是有益的，因为蚊子通常接种< 5μl。
2. <70>通过用70％乙醇冲洗至少三次，将可重复使用的玻璃注射器和针头（图7）组装和消毒。用无菌PBS冲洗三次
  
  图7.汉密尔顿玻璃注射器和针头
  。
3. 对于20μl注射液，将总共25μl的唾液腺提取物吸收到玻璃注射器中，同时排除气泡。避免接触管的表面，以避免可重复使用的针头尖端变钝。
4. 同时，通过在2L / min氧气流中吸入2-4％异氟烷来麻醉小鼠。调整吸入时间和异氟烷百分比，直到鼠标每秒钟大约呼吸一次。从麻醉中取出后，小鼠仍然麻醉约1分钟，以进行皮内接种。
  注意：经过异氟烷吸入的小鼠麻醉必须由经过培训的实验室人员进行。
5. 使用盖滑动镊子使麻醉的小鼠的一只耳朵固定，使得耳朵的腹侧面朝上。镊子的底部应该在注射部位大致在耳朵的中心。向后倾斜耳朵并清除耳部皮肤中的褶皱（图8A）。
  注意：为了避免将耳朵粘到镊子上，请确保注射前的耳朵皮肤干燥。必要时，用纸巾或纱布干燥皮肤。另见视频2，真皮内接种。
  
  Video 2. Intradermal inoculation of the mouse ear
  
  图8.小鼠耳朵的真皮接种
  ＆nbsp;
6. 强制镊子的朝向顶部的部分，以及耳朵背侧部分（朝外）朝向底部。因此，形成“台阶”或“壁架”将为注射部位提供坚实的支持（图8A）
7. 用斜面朝上的方式握住针头。接近需要保持在〜45°角度的“凸缘”，并轻轻地穿透皮肤表面（图8B）。
8. 降低针的45°角，直到其平行于镊子和皮肤，同时精确地保持针尖的位置。然后平行于皮肤，应该感觉到镊子沿着针的长度的支撑（图8C）。
9. 插入针〜3毫米，同时平移于皮肤组织内的表面。应该感觉到很大的阻力，并通过皮肤表面不断地看到针的斜面（图8D）。如果阻力突然降低或不能再看到斜面，针头可能会穿过皮肤背面（如果发生这种情况，请在拆下镊子和针头后再次尝试）。
10. 仔细放开镊子，而不会相对于针头移动耳朵皮肤（图8E）。
11. 移动握住镊子的手，另一只手到达注射器的柱塞。
12. 慢慢接种 20μl溶液，并监测皮肤下面的小水泡的外观（图8F）。成功的注射导致耳朵的瞬时僵硬（由小水泡引起），并且在注射时应该感觉到一些阻力。如果不发生水疱发生或不发生僵化，接种物可能已经通过耳朵后面渗漏。如果发生这种情况，请取下针头并重新插入耳朵稍微不同的位置。
13. 如果少量的接种物通过皮肤前部或背部渗漏，请用额外的5μl补充该体积，将其吸入注射器，以确保注射完全20μl。如果接种体积仍然< 20μl，在同一耳朵皮肤的不同部位接种更多。
14. 接种后，用镊子握住耳朵的一侧（不是水泡形成的地方），并慢慢移除针头。
  注意：一旦初次穿刺皮肤变得更加困难（每6-10次实验），开始使用新的针头。
15. 在整个程序中，仔细观察麻醉鼠标的呼吸。此外，在从麻醉中醒来期间和之后定期监测小鼠。
16. 使用后，使用漂白剂或其他消毒剂冲洗几次，然后用PBS然后70％乙醇清洗玻璃注射器。为了重复使用玻璃注射器，每个试剂（例如，单独的SGE，单独的病毒，单独的SGE +病毒，PBS单独）指定一个注射器，以避免交叉污染。玻璃注射器和针头也可以被高压灭菌。

数据分析

有关动物实验和道德审批的详细信息，使用的方法，数据处理和分析以及用于生成图9中的示例数据的统计测试，请参阅我们的原始出版物（根据开放获取知识共享署名许可[Schmid 等等，2016]），从中提取了数据的代表性例子（下面）：

图9. SGE的皮内接种诱导血管渗漏到皮肤中，并加重感染小鼠模型中的登革热病。A.用Alexa Fluor 680标记的葡聚糖静脉内接种野生型小鼠。之后立即将15μlSGE或PBS皮内接种。 30分钟后，将小鼠安乐死，并使用Odyssey CLx红外成像系统（Licor）扫描耳朵。代表性的扫描显示在皮肤接种的位置或稳态耳朵中的相应区域（白色圆圈）等离子体泄漏到皮肤中的荧光。 B.用干酪素-α/β受体缺陷的小鼠（ - / - ）用登革热病毒-2菌株D220在不存在或存在增强抗体（5μg单克隆抗体4G2，靶向登革病毒E蛋白））以模拟抗体依赖性增强（ADE）。登革热病毒单独或与Ae混合后接种。 aegypti SGE（+ SGE）。 Kaplan-Meier曲线显示小鼠的生存。从三个实验汇总数据。使用对数秩（Mantel-Cox）测试在SGE的存在和不存在之间测试统计学上的显着性差异，并将其标记为**用于P < 0.01。

致谢

所有使用小鼠的实验均经过美国加利福尼亚大学伯克利分校（AUP-2014-08-6638）和比利时鲁汶大学伦理委员会的批准并严格遵守。（P140-2016）。加利福尼亚大学伯克利分校的这一协议的开发和使用得到了美国国家过敏和传染病研究所，国家卫生研究院授予R01 AI085607（EH）和德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的支持。 >），SCHM 3011 / 1-1（MAS）研究奖学金。我们要感谢Johan Neyts和Kai Dallmeier的支持，Ruben Pholien的技术援助和KU Leuven Rega基金会的博士后研究金（MAS）。来自比利时联邦科学政策办公室（Belspo）的比利时病毒学协会（BELVIR）的IVAP项目支持了鲁汶大学实验室的原始工作。该协议最初被建立以在Schmid等人，2016中生成主要数据，并在其中简要描述。

参考

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