材料和试剂

15ml离心管（VWR，目录号：89004-368）
清洁平底黑色96孔培养托盘盖（康宁，目录号：3904）
野生型（WT）人类1321N1星形细胞瘤细胞缺乏P2受体和表达1321N1细胞的hHA-P2Y 2 R R（来自密苏里大学Dr.Gary A.Westisman的礼物）
DPBS
胰蛋白酶（TrypLE Express）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：12604013）}
丙磺舒（水溶性）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：P36400）}
腺苷5'-三磷酸二钠盐（ATP）（Tocris Bioscience，目录号：3245）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
Fura-2-乙酰氧基甲酯（fura-2 AM）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：F1225）}
Pluronic F-127,20％（w / v）储备在DMSO中（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：P3000MP）}
Dulbecco改良的Eagle中等葡萄糖（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D2902）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F6178）
抗生素/抗生素（Sigma-Aldrich，目录号：A5955）
遗传霉素，G418（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10131035）}
HEPES缓冲盐水（HBS），pH 7.4（参见食谱）
染色溶液（参见食谱）
野生型（WT）人类1321N1星形细胞瘤细胞培养基（见食谱）
表达1321N1细胞的hHA-P2Y 2 R R的培养基（参见食谱）
低血清培养基（见食谱）

设备

Tecan Infinite M200 ^{®（Tecan Trading，型号：Infinite ^{® M200）}}
费雪科学小涡（Fisher Scientific）
Eppendorf 5810R台式离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
Biorad TC10细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，型号：TC10 ^{TM自动细胞计数器）
注意：本产品已停产。}
Fisher Scientific Isotemp CO 2培养箱（5％CO 2，37℃）（Fisher Scientific）
层流生物罩

软件

i-Control ^{®（瑞士Tecan Trading AG）}
Excel ^{®（Microsoft）}
GraphPad Prism ^{®（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA）}

程序

细胞培养和fura-2加载
1. 在培养箱（37℃，5％CO 2）中用适当培养基保持细胞。
2. 将细胞生长至90％融合，弃去细胞培养基，用DPBS洗涤并与胰蛋白酶分离。
3. 用5ml细胞培养基重新悬浮分离的细胞并转移到15ml离心管中。
4. 以300×g离心5分钟。
5. 弃去细胞培养液，并用5ml低血清培养基重新悬浮细胞
6. 在透明的平底黑色96孔培养皿中以3.0×10 4细胞/孔（80-90％汇合）的密度进行实验前16小时的种子细胞。
7. 通过小心翻转平板并用200μlHEPES缓冲盐水清洗一次，弃去培养基。仔细倒置HBS，更换染料溶液，并在室温下在黑暗中孵育1小时。
8. 通过翻转板去除染色溶液，用HBS洗涤两次，并用200μl补充有2.5mM丙磺舒的HBS覆盖在室温下至少20分钟以允许fura-2AM去酯化。
注意：细胞介质必须不含酚红，以避免荧光测量的干扰。为了避免蒸发，请记住在孵化期间将盖板盖回来。＆nbsp;
仪器设置
1. 打开Tecan i-Control软件并输入以下参数：
  
  表1. Tecan Infinite M200的双波长Ca ^{2 + 指示剂测定参数和仪器设置 ^{® 与注射器。优化设置以测量ATP刺激1321N1星形细胞瘤细胞中的细胞内Ca 2+活性。}}
2. 在进行测定之前，建议先用蒸馏水，然后用HBS清洁注射器和管道。
3. 主注射器A与1.1mM ATP溶液
4. 设置测量参数，插入板，取下盖板并开始运行。使用表1中规定的参数，在340个采集周期内，每3秒钟以340和380 nm交替激发波长确定510 nm处的荧光发射强度。

数据分析

为了在细胞中表达细胞内钙浓度，计算响应于340/380nm激发的510nm发射的比率。
使用前9个周期的平均值（未刺激）作为基准来归一化Ca ^{2 + 动员。}
有关数据处理，请参见附录例如

笔记

Fura-2 AM在某些染色条件下可以积累到细胞器（内质网，内体/溶酶体，线粒体，细胞核）中。必须测试染料浓度，孵育时间和温度的组合，以最小化分隔成细胞器的染料的量（通过共聚焦显微镜测试）。本方案中使用的实验条件已针对1321N1星形细胞瘤，C6胶质瘤和DI TNC细胞系进行了优化。
最佳的fura-2加载时间和去酯化时间可以根据细胞类型凭经验确定。 Fura-2 AM，Pluronic F-127，本方案中阐述的丙磺舒浓度和孵育时间已针对1321N1星形细胞瘤，C6胶质瘤和DI TNC细胞系进行了优化。
受体激动剂溶液制备：

激素解决方案需要考虑到体积和仪器注射器要分配的体积。
初始体积= 200μl
体积分配= 20μl
最终体积= 220μl
所需的激动剂浓度=100μMATP
激动剂储备浓度= 1.1mM ATP

Tecan i-Control参数针对该协议进行了优化，必须凭经验确定
HBS可以在4°C储存。使用前请保持室温。
在室温下储存Pluronic F-127 20％溶液。如果观察到沉淀物，则可以通过在〜40℃下加热使产物再次溶解并在使用前涡旋

食谱

HEPES缓冲盐水（HBS），pH 7.4
145 mM NaCl
5 mM KCl
1mM CaCl 2
1mM MgCl 2
10 mM HEPES
10 mM葡萄糖
染色溶液
HEPES缓冲盐水（HBS），pH 7.4
0.1％BSA（w / v）
5μFfura-2 AM
0.05％Pluronic F-127
野生型（WT）人类1321N1星形细胞瘤细胞的培养基 DMEM
10％胎牛血清（FBS）
1％抗生素/抗生素
表达1321N1细胞的hHA-P2Y 2 R的培养基
DMEM
10％胎牛血清（FBS）
1％抗生素/抗生素
500μg/ ml遗传霉素，G418
低血清培养基
DMEM
1％胎牛血清（FBS）

致谢

从UPR-MSC的生物医学科学副主任收到对MMA和NAM的部分支持。波多黎各大学分子科学研究中心进行实验。 1321N1星形细胞瘤细胞（WT和P2Y 2 R表达）是密苏里大学Gary A. Weisman博士的礼物。

参考

Burgos，M.，Neary，JT和Gonzalez，FA（2007）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17868308”target = “_blank”> P2Y2核苷酸受体抑制创伤诱导的星形胶质细胞死亡。 J Neurochem 103（5）：1785-1800。
Martínez，NA，Ayala，AM，Martínez，M.，Martínez-Rivera，FJ，Miranda，JD and Silva，WI（2016）。＆nbsp; Caveolin-1调节人1321N1星形细胞瘤细胞中的P2Y2受体信号传导。 291（23）：12208-12222。