材料和试剂

移液器提示
CoverGlasses（Thermo Fisher Scientific或VWR）
Falcon管（50毫升）
猎鹰管（15毫升）
无菌移液器5,10,25 ml
12孔培养板
10，15厘米细胞培养皿
剃刀刀片
火抛光玻璃巴斯德移液器

注意：材料＃3-9可以来自各种供应商。

微流控室（XONA MICROFLUIDICS，目录号：SND450）
过滤单元（150,250ml）（EMD Millipore，目录号：SCVPU02RE，0.10μm，聚醚砜）
怀孕的雌性Sprague Dawley大鼠（胚胎在E17.5解剖）（Harlan Sprague Dawley）
在dH 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）中的0.1％（w / v）的聚-L-赖氨酸
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（不含CaCl 2，MgCl 2）（Thermo Fisher Scientific，Gibco＆lt; sup＆gt;目录号：1419094） br />
70％乙醇
10倍，2.5％胰蛋白酶，无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15090046）}
10x DNase I（10mg / ml）（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
抗TrkA抗体
10x汉克斯平衡盐溶液（HBSS）不含PR，sod.bicarb，CaMg（Mediatech，目录号：20-023-CV）
青霉素 - 链霉素（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
Neurobasal-A培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10888022）}
胎牛血清（FBS）（Qmega Scientific，目录号：FB-02或各种供应商）（使用前激活加热）
50x B27补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：17504044）}
100x GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM ，目录号：35050061）}
如先前公布的小鼠纯化的NGF（Mobley等人，1986）
解剖缓冲（见配方）
电镀介质（见配方）
维护媒体（见配方）

设备

无菌细胞培养罩（Esco Micro，型号：Class II Type A2）
剪刀
＃5生物制品力量和小弹簧剪刀（精细科学工具）
移液器
水浴（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Precision ^{TM 型号281）
注意：本产品已停产。}}
细胞培养箱（Panasonic，型号：MCO-19AIC UV-PA）
解剖显微镜（Leica，型号：Leica S8 AP0）
细胞培养离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：CL2）}
高压釜（STERIS，型号：AMSCO ^{® Evolution ^{®蒸汽灭菌器）}}

程序

制备
1. 在4℃下使用聚-L-赖氨酸（PLL）12小时的涂层板/覆盖层或在37℃下2-4小时。将覆盖层浸入10cm细胞培养板中的PLL中。为了涂覆12孔培养板，将0.5ml PLL加入到每个孔中以覆盖整个表面。
2. 用1ml冷PBS洗涤3-4次，然后用1 ml无菌水快速冲洗，并在无菌细胞培养罩中空气干燥板或覆盖物。
3. 消毒70％乙醇中的所有解剖工具
胚胎解剖（所有手术已获得UCSD IACUC批准）
一只Sprague Dawley女性怀孕大鼠（E17.5）
1. 在批准的CO 2 室麻醉大鼠。
2. 执行宫颈脱位。
3. 用70％乙醇消毒大鼠的腹部。
4. 用剪刀以T形切割皮肤，在前方向后方，在生殖器区域正上方交叉切割。
5. 以类似的模式切开肌肉组织。
6. 找到子宫的角，用剪刀切割，取出子宫。
7. 将子宫放置在10厘米TC盘中，沿子宫切割，使其羊膜和胎盘中的每个胚胎脱落。
8. 从其羊膜囊中取出每个胚胎，并转移到10厘米的TC H皿中，以覆盖所有的胚胎。将这碟放在冰上。
注意：对于B3-B8步骤，请参阅Pacifici和Peruzzi（2012）中的优秀视频演示。
BFCN解剖
1. 将胚胎置于冰上10厘米的TC盘中。并且在室温或冰上进行以下解剖手术。
2. 用剃须刀刀头拆下头部。
3. 使用＃5生物镊子切割皮肤和软骨以暴露整个大脑。
4. 轻轻取出大脑，放在10厘米TC盘上
5. 切除并清除嗅结节，小脑和脑干。
6. 小心地去除脑膜（脑膜会从脑部分开，当组织浸入1 HBSS时，从组织边缘开始变得更加明显，使用镊子，尽可能地完全从皮肤上剥离红色的薄膜。）。
7. 基底前脑恰好靠近大脑半球的内侧和腹侧。
8. 沿着矢状缝线轻轻打开大脑半球以露出间脑和基底前脑。
9. 进行横切，将基底前脑的后侧与间脑的前极分开。
注意：对于步骤C1-C9，请参阅Schnitzler等人，2008年的优秀照片和视频演示。＆nbsp;
1. 将基底前脑组织置于带有1 HBSS的15 ml管中，并将管置于冰中
2. 重复步骤C1-C9并收集所有BFCN组织。
BFCN的机械/酶分解
1. 用5ml冷的1 HBSS洗涤BFCN组织，重复4次。
2. 用移液器移除缓冲液。
3. 加入1.8ml 1x HBSS，0.2ml 10x胰蛋白酶（2.5％）
4. 在37°C水浴中孵育15分钟。
5. 加入0.2 ml 10x DNA酶（10 mg / ml），用火抛光玻璃巴斯德移液管轻轻吸管10-15次，直到混合物变成均匀的悬浮液，没有可见的未消化的组织。
6. 预热电镀介质在37°C使用前。
7. 加入5ml预热的电镀介质，并在室温下以500×g（或1000rpm）旋转5分钟。
8. 去除上清液
9. 加入电镀介质（体积通过所需电镀密度/方法确定）注意：对于12孔板，每孔500μl，或用于覆盖玻璃的150μl。
10. 30分钟后，加入1ml电镀培养基，并放入37℃CO 2培养箱中。
11. 第二天更换维护媒体。文化可以维持10-14天，其中一半的媒体每隔一天变成新鲜媒体。

数据分析

神经元可以在微流体室中培养（图1A，左图：DIC图像;右图：具有抗-TrkA抗体的免疫染色图像）以将神经元细胞从长轴突分离以研究轴突运输。神经元也可以用于其他应用的涂层覆盖物上的大量培养。例如，使用免疫染色来证实在具有抗胆碱乙酰转移酶（ChAT）的特异性抗体的培养物中胆碱能（DIV7），NGF反应性神经元的存在，胆碱能神经元的标记物和NGF的受体TrkA（图1B ）。大多数神经元（> 90％）对于两种标记都是阳性的（Xu等人，2016）。

图1.大鼠E18基底前脑胆碱能神经元（BFCN）的培养物。 A.在微流体室中培养的原代BFCN（DIV7）（左：DIC;右：抗-TrkA免疫染色）的代表性图像。刻度棒=50μm。 B.胆碱能神经元标记物ChAT（红色）和NGF受体TrkA（绿色）的原代BFCN（DIV7）的代表性图像。比例尺=10μm
注意：对于代表性的照片和结果，请参阅（Xu et al。，2016）。

食谱

解剖缓冲液（过滤器灭菌）
10毫克汉克斯平衡盐溶液（HBSS）
89毫升ddH 2 O - / - 1 ml Pen / Strep
电镀介质（过滤器灭菌）
43.5毫升Neurobasal媒体
5 ml FBS
1 ml 50x B27
0.5ml 100x GlutaMAX
维护媒体
电镀培养基加50ng / ml NGF（终浓度）

致谢

该方案根据Schnitzler等人描述的方法进行了改进。（2008年）。该研究得到以下资助：NIH（PN2EY016525），NIH UCSD ADRC P50试点奖学金，唐氏综合症研究和治疗基金会，Larry L. Hillblom基金会，中华人民共和国科技部Tau联盟（ 2014CB965002，2012BAI10B03），中国国家自然科学基金（81171200），上海市科学技术委员会（13JC1401502,131340904000），上海市教委（12ZZ115）。

参考

Mobley，WC，Rutkowski，JL，Tennekoon，GI，Gemski，J.，Buchanan，K.and Johnston，MV（1986）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi .nlm.nih.gov / pubmed / 3742234“target =”_ blank“>神经生长因子增加胆碱乙酰转移酶在发育基础前脑神经元中的活性。 386（1）：53-
Pacifici，M.和Peruzzi，F。（2012）。大鼠胚胎神经细胞的分离和培养：快速方案。

Schnitzler，AC，Lopez-Coviella，I. and Blusztajn，JK（2008）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18193019”目标=“_ blank”>神经生长因子受体（p75）表达的基础前脑胆碱能神经元的纯化和培养 Nat Protoc 3（1）：34-40。

Xu，W.，Weissmiller，AM，White，JA，2nd，Fang，F.，Wang，X.，Wu，Y.，Pearn，ML，Zhao，X.，Sawa，M.，Chen，S.，Gunawardena ，S.，Ding，J.，Mobley，WC and Wu，C。（2016）。＆nbsp; 淀粉样蛋白前体蛋白介导的内吞途径破坏引起轴突功能障碍和神经退行性疾病。 J Clin Invest 126（5）：1815-1833。