材料和试剂

注意：所有使用的试剂均来自指定的制造商（目录号）。尽管如此，来自不同制造商的相同试剂也有望产生类似的结果

Spatula
称重船（Sparks Lab Supplies，目录号：BAL1822）
手套（Sparks Lab Supplies，目录号：SAF5534X20）
无菌微量吸头（100-1,000μl）（Abdos Labtech，目录号：P10102）
无菌微量吸头（2-200μl）（Abdos Labtech，目录号：P10101）
微量离心管（1.5ml）（Abdos Labtech，目录号：P10202）
离心管（15 ml刻度）（Abdos Labtech，目录号：P10402）
Cuvette（LP ITALIANA，目录号：112117）
2 mm实验室试验筛（B5410 / 1986，Endecotts，目录号：200SIW2.00）
96孔板（TC microwell 96U）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：163320）}
90毫米培养皿（Abdos Labtech，目录号：P10901）
土壤土壤
大肠杆菌菌株
1. 电子。大肠杆菌COB583（Somorin等人，2016）
2. 电子。大肠杆菌COB583Δ（Somorin等人，2016）
注意：大肠杆菌储存培养物在含有7％二甲基亚砜（v / v; Sigma-Aldrich）的LB中制备，并保持在-80℃待用。
Luria-Bertani（LB）肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022-1KG）
琼脂2号（实验室M，目录号：MC006）
MacConkey琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：M7408）
蒸馏水（Milli-Q）（EMD Millipore）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
LB肉汤（见食谱）
LB琼脂平板（参见食谱）
PBS缓冲液（参见食谱）
MacConkey琼脂平板（参见食谱）

设备

250毫升锥形瓶（VWR，目录号：214-1132）
-80°C冰箱
泡沫塑料15毫升管夹
本生灯
轨道摇床（Gallenkamp）
发现舒适多通道移液器（20-200μl; HTL）
发现舒适多通道移液管（5-20μl; HTL）
Nichipet EX吸管（200-1,000μl; Nichiryo）
Nichipet EX Pipetman经典移液器（20-200μl; Nichiryo）
涡旋搅拌机（Reax top; Heidolph）
Biomate 3分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：335904）
注意：本产品已停产。
称重秤（Sartorius，目录号：BL120S）
注意：本产品已停产。
离心机（Eppendorf，型号：5418）
Labo高压釜（SANYO，型号：MLS-3020U）

程序

通过光密度（OD 600nm）测量细胞浓度
1. 将保存在-80℃冷冻箱中的储存培养物中的大肠杆菌COB583野生型和缺失型突变体（COB583ΔnPoS）分离到LB琼脂（参见食谱）在本生灯周围，并在37℃孵育过夜（〜16小时）。
2. 将一个菌株的一个菌落用一次性无菌接种环接种在本氏燃烧器周围的无菌锥形瓶中的10ml LB中，并在37℃孵育6小时。对每个菌株进行一式三份的这一步骤。
3. 从6小时培养物中取100μl加入到900μlLB中并测定OD 600nm 。
4. 确定在25ml LB中使起始OD 600nm <0.05的所需培养物的体积如下：
  C 1 _{1 2 2＆lt; 2＆gt;
  6小时培养物的C = 600nm; V <1> = 6小时培养物的体积 C 2 O 2 =所需的最终OD 600nm ; V _{2 =最终卷需要
  V 1 = 0.05×25ml /℃1 / / 2}}
5. 在每个菌株的25ml LB中制备起始OD 600nm <0.05的培养物，并将它们各自在无菌250ml锥形瓶中重复，并在37℃下在振荡器上温育烧瓶过夜。 >
6. 第二天，在LB中稀释1:10的过夜培养物，并测定OD 600nm 。
7. 将1ml每个过夜培养物移取到每个菌株的两个分开的无菌的1.5ml管中，并分别进行复制
8. 在室温（23-25℃）下以9,000 x g离心培养物10分钟，用无菌移液管除去上清液。
9. 通过将其悬浮在无菌PBS（参见食谱）中并以9,000×g离心10分钟来洗涤细胞沉淀。重复洗涤步骤两次。
10. 通过上下吸取将洗涤的细胞沉淀物重悬于1ml无菌PBS中并涡旋并稀释1：2; 1：5; 1:10; 1:20; 1：100;和1：1,000在无菌PBS中，使其在无菌微量离心管中制成1ml
11. 将每个稀释的细胞悬浮液转移到比色皿中，并确定E细胞悬液的OD 600nm。大肠杆菌菌株及其各自的重复在分光光度计中三次并确定平均值。
12. 对每个细胞悬浮液进行连续稀释，并将其放在LB平板上一式三份，并在37℃孵育平板过夜。
13. 计数菌落，并使用派生的数据估计细胞计数（CFU ml ^{-1 ），并从一式三份的实验中确定平均细胞数。}
14. 在三个独立实验中绘制平均细胞数相对于每个菌株的相应稀释度的平均OD 600nm，以获得可从其获得所需细胞数的校准曲线。细胞计数与OD 600 nm 的曲线图的标准曲线如图1所示
  
  图1. COB583（A）和COB583ΔrpoS的细胞数与OD 600的相对标准曲线（B）
土壤生存测定的发展
1. 将COB583和COB583ΔrpoS各自的一个菌落一式三份接种到25ml LB中，并在37℃下孵育过夜。
2. 在LB中稀释所得培养物1:10并测定OD 600nm
3. 将2ml过夜培养物加入到两个无菌Eppendorf管中，每个重复两个菌株。
4. 如上所述洗涤培养物（步骤A8和A9）。
5. 将所得细胞沉淀物收集并重悬于2ml无菌PBS中的15ml试管中
6. 将每个洗涤的细胞悬浮液稀释1:10（1ml），以确定OD 600nm 。
7. 基于OD600nm，从每个重复制备具有OD 600纳米相当于2×10 8 CFU ml -1的标准化细胞悬浮液。
8. 对每个标准化的细菌悬浮液进行连续稀释，并在LB琼脂上点样10μl每种稀释液一式三份。让斑点风干，并在37℃孵育板过夜。计数菌落并确定平均细胞计数。
9. 用2毫米实验室试验筛筛分土壤，称取1克筛分土壤至15毫升管中。
10. 取每个菌株每个标准化细菌悬浮液50μl，并将其接种到土壤中（给予〜1×10 7个土壤的CFU g ^{1）。未接种的对照物应该加入50μl无菌PBS。实验为每个菌株设置一式三份。}
11. 用盖子盖住管子，用手将它们倒置10次以进行适当的混合。
12. 在室温（23-25°C）下放置管约10分钟。
13. 执行接种的E的恢复。通过向每个15ml管中加入2ml无菌PBS至大肠杆菌菌株。用盖盖住管子，反复三次，立即旋转20秒两次。
14. 将管放在工作台上，使得所得土壤泥浆中较大的土壤颗粒沉降（2-10分钟，取决于土壤质地）（图2）。
  
  图2.刚刚混合后和沉淀后的土壤泥浆土壤生存测定的实验设置
15. 从每个土壤浆液的上清液中取20μl，将它们置于96孔板的分开的孔中，并从其中进行连续稀释（最多10次至-6℃）。
16. 取10μl每种稀释液，并一式三份放在MacConkey琼脂平板上（见食谱），并在37℃下孵育板过夜。
17. 计算菌落，并使用得到的数据从一式三份的实验中估计平均回收细胞数（CFU ml ^{-1 ）。确定细胞的回收百分比。＆nbsp;}

数据分析

每个重复的细胞计数由从每个重复中的三个点获得的平均细胞计数表示。从标准化的细胞悬浮液（接种物）中获得细胞计数的平均值和标准偏差，并从每个菌株的三个独立重复获得回收的细胞计数。恢复的百分比范围为30-79％，来自该程序的回收细胞如图3所示

图3.从土壤中回收大肠杆菌在回收细胞上提供百分比恢复。

笔记

在接种土壤前，应确认接种物的光密度准确
接种土壤时应注意确保移液器吸头不要直接接触土壤，因为它可以防止移液器吸头的整个内容物的释放。
当细胞悬浮液在琼脂平板上发现时，应注意使用移液器吸头刺穿琼脂。这可能会改变每个地点产生的细胞数。
应检查使用的土壤，并确认不含有E。在土壤存活测定之前，使E.coli 恢复。大肠杆菌只能归因于接种的E.大肠杆菌。将通过2mm筛网筛选的1g土壤的系列稀释液涂布在MacConkey琼脂上，并在37℃下孵育以确定其结果。
对于长期的土壤生存实验，管应该稍微加盖以允许空气交换并在所需温度下静态温育。应设置多个试管，用于在不同时间点进行抽样的实验，因为接种的土壤被破坏性采样（即添加了PBS，不能在另一个时间点重新使用）。大肠杆菌恢复。
当等分试样连续稀释和电镀细胞计数确定之前，将土壤浆液静置2分钟和10分钟后，没有显着差异。

食谱

LB肉汤
向1升蒸馏水中加入20克LB粉末，并加热高压釜
LB琼脂板
向1L蒸馏水中加入20g LB粉末和15g琼脂2粉末，并加热。当冷却触摸（约45°C）时，将约25ml的熔融琼脂倒入培养皿中，并使其固化。
PBS缓冲液
将一个磷酸盐缓冲盐水溶液（Sigma-Aldrich）溶解在200ml蒸馏水中并进行高压灭菌，得到PBS缓冲液（pH 7.4）
MacConkey琼脂板
将50克MacConkey琼脂粉末加入1升蒸馏水中并加热。当冷却触摸（约45°C）时，将约25ml的熔融琼脂倒入培养皿中，并使其固化。

致谢

该协议是从以前发表的作品（Somorin等人，2016）改编而成。作者感谢Camila Thorne的帮助和建议，建立了土壤生存测定。这项工作由NUI戈尔韦理工学院博士支持。奖学金和Thomas Crawford Hayes研究奖给Y.S.

参考

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