材料和试剂

大肠杆菌：DH5ɑ（sanyou Biopharmaceuticals）
S上。酿酒酵母菌株：W303（MATa ura3-52）
pCRCT质粒（Addgene，目录号：60621）
鲑鱼DNA（Sigma-Aldrich，目录号：D1626）
限制酶：10U /μlBsa l（Takara Bio）
10倍缓冲液G（Takara Bio）
Taq DNA聚合酶（Takara Bio）
抗生素：100μg/ ml氨苄青霉素（Siyao）
纯质粒小套件（CWBIO）
酵母基因DNA试剂盒（CWBIO）
DNA寡核苷酸引物（GENEWIZ）
PEG：聚（乙二醇），BioXtra平均分子量3,350（Sigma-Aldrich，目录号：P3640）
注意：本产品已停产。
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
葡萄糖
琼脂（Solarbio，目录号：A8190）
氯化钠（NaCl）（天津凯美化学试剂）
蛋白胨
引物
CasYZF：5'--- ACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGG --- 3'
CasYZR：5'--- TAGTATGCTGTGCTTGGGTGTT --- 3'
葡萄糖（天津凯美化学试剂）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich）
乙酸锂二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：L6883-1KG）
琼脂糖凝胶回收试剂盒（Biomiga）
YPD液体介质（见配方）
LB平板（含适当的抗生素）（参见食谱）
YPDA液体介质（见配方）
没有尿嘧啶的SC培养基（参见食谱）

设备

PCR机器（或类似产品）（Biometra，型号：TPfofessional）
42℃水浴（或类似物）（XINBAO，目录号：HH-501BS）
DNA电泳装置（或类似物）（SIM International，型号：BIO-PRO 200E，目录号：0401RHSI049）
微量离心机（SCILOGEX，型号：D2012）
孵育器（或类似的，能够在37℃或28℃孵育琼脂平板）（CIMO，型号：DNP-III）

程序

查找非必需的 S。使用以下数据库之一进行基因（其删除或失活不会导致致死率）：
http://www.yeastgenome.org/
http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast /
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
为CRISPR阵列设计两个20个核苷酸（nt）间隔序列使用在线工具E-CRISP设计CRISPR阵列的两个20 nt间隔序列。设计间隔序列时应考虑以下因素：
1. 间隔序列长度一般为17-20nt。用于化脓性链球菌Cas9（SpCas9）的原始相邻基序（PAM）是5'-NGG-3'。
2. 间隔序列可以位于非转录链或转录链上
3. 选择的间隔序列应该是特异性的，以避免脱靶效应。
  工具E-CRISP有助于设计特定于位置的间隔序列。
  （ http://www.e-crisp.org/E- CRISP / ）
构建crRNA-Cas9质粒
1. 必须合成含有两个间隔序列和两个部分直接重复序列的crRNA转录本的dsDNA插入片段（图1）。
  
  图1.用于crRNAs表达的dsDNA的示意图
2. 使用Bsa I消化用于crRNA转录的dsDNA插入片段并克隆到BaxI消化的pCRCT质粒（Bao等人，2015）中，。
3. 将dsDNA插入片段连接到pCRCT质粒中
4. 变换E。大肠杆菌DH5α感受态细胞与连接产物。
5. 使用纯质粒Mini Kit从转化的DH5α细胞中提取质粒
6. 将crRNA-Cas9质粒转化成S。使用LiAc / SS载体DNA / PEG方法的酿酒酵母感受态细胞（Gietz等人，2007）。
Cas9-crRNA介导的大片段缺失的验证。酿酒酵母。
1. 为了验证Cas9-crRNA介导的大片段缺失，需要一对基因特异性引物来扩增靶向区域。
2. 在不含尿嘧啶的5ml SC培养基中，从选择板中挑取阳性克隆，并在28℃下孵育并在200rpm下摇动4天。
3. 提取 S。使用酵母基因DNA试剂盒的来自步骤D2的酿酒酵母基因组DNA。
4. 使用从转基因S提取的基因组DNA进行PCR扩增。具有以下PCR程序的啤酒酵母：
  注意：基于靶区域侧翼的扩增连接序列的序列设计P 1和/或2＆gt; 2＆gt;引物（图2，表1）和扩增子只有在发生大量缺失时，才可能穿过结扎结。 P 3 _{8'引物可以证实结果。引物可以由Primer3设计（长度：18-25，GC含量：40％-60％）。
  PCR协议
  95 °C    5 min    1 cycle
  95 °C    30 sec
  X °C       30 sec   30 cycles
  72 °C    N min
  72 °C    5 min    1 cycle
  4 °C      Hold     1 cycle
  注意：退火温度（X）和延长时间（N）取决于引物。
  
  图2.本协议中描述的CRISPR / Cas9的大片段删除。
  
  参见表1，以获得P 1-Sub 8，gRNA1和gRNA2的序列
  
  表1. P1-P8，gRNA1和gRNA2的序列}
5. 通过电泳验证PCR产物（图3）
  
  图3.确认大染色体修饰 A. M，标记;泳道1，突变体;车道2，控制。 B，C和D。具有引物P 3 - 3 - 4，P 5 - 6 - 6的PCR产物，目标区域中的第7〜第_ 8个子区域，1a，1b，1c，亲本菌株。 2a，2b，2c，删除。＆nbsp;

笔记

在这个协议中，大规模的删除效率只有10％。可能的原因是DSB可以通过NHEJ进行修复，这通常会导致中断站点的小插入和/或删除（indel）。虽然HDR路径允许高保真度和精确的编辑，但是大规模删除的效率在。如果目标载体含有靶基因的同源性臂，则可以改善酿酒酵母。

食谱

注意：介质溶剂为ddH 2 O。

YPD液体介质
1％（w / v）酵母提取物 2％（w / v）胰蛋白胨
2％（w / v）葡萄糖
高压灭菌并储存在4°C
LB板（含适当的抗生素）
1.5％（w / v）琼脂
1％（w / v）胰蛋白胨
0.5％（w / v）酵母提取物 1％（w / v）NaCl
高压灭菌器
YPDA液体介质
2％（w / v）蛋白胨
2％（w / v）葡萄糖
1％（w / v）酵母提取物 0.005％（w / v）腺嘌呤
高压灭菌并储存在4°C
没有尿嘧啶的SC培养基
2％（w / v）葡萄糖
0.67％（w / v）酵母氮碱高压灭菌并储存在4°C

致谢

这项工作得到了河北省重点实验室（3333112），生物工程重点学科开放式基金的支持。

参考

Bao，Z.，Xiao，H.，Liang，J.，Zhang，L.，Xiong，X.，Sun，N.，Si，T。和Zhao，H。（2015）。用于酿酒酵母中一步多基因破碎的同源性CRISPR-Cas（HI-CRISPR）系统。 ACS Synth Biol 4 （5）：585-594。

Cong，L.，Ran，FA，Cox，D.，Lin，S.，Barretto，R.，Habib，N.，Hsu，PD，Wu，X.，Jiang，W.，Marraffini，LA and Zhang，F 。（2013）。使用CRISPR / Cas的多重基因组工程系统。科学 339：819-823。

Gietz，RD和Schiestl，RH（2007）。 Frozen使用LiAc / SS载体DNA / PEG方法可以高效转化的感受态酵母细胞。 Nat Protoc 2（1）：1-4。

Hirashima，K.，Iwaki，T.，Takegawa，K.，Gigahama，Y.and Tohda，H。（2006）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/?term=A+simple+and+effective+chromosome+modification+method+for+large-scale+deletion+of+genome+sequences+and+identification+of+essential+genes+in +裂变+酵母“。 target =“_ blank”>用于大规模删除基因组序列和鉴定裂殖酵母中必需基因的简单而有效的染色体修饰方法。核酸研究34（2）：e11 。

Varshney，GK，Pei，W.，LaFave，MC，Idol，J.，Xu，L.，Gallardo，V.，Carrington，B.，Bishop，K.，Jones，M.，Li，M.，Harper， U.，Huang，SC，Prakash，A.，Chen，W.，Sood，R.，Ledin，J.and Burgess，SM（2015）。＆nbsp; 使用CRISPR / Cas9的斑马鱼中的高通量基因靶向和表型。 Genome Res 25 （7）：1030-1042。

Zhou，H.，Liu，B.，Weeks，DP，Spalding，MH and Yang，B。（2014）。＆nbsp; 大型染色体缺失和由CRISPR / Cas9在水稻中诱导的遗传性小遗传变化。核酸Res 42（17）：10903 -10914。