材料和试剂

50ml管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
微管2 ml（SARSTEDT，目录号：72.691）
微管2毫升带帽（SARSTEDT，目录号：72.694）
玻璃珠（0.25至0.5毫米）（Carl Roth，目录号：A553.1）
大肠杆菌菌株：MC4100（野生型）和TJ2e（Δκα），（Jaeger等人，2005）
丙酮（CH 3 COCH 3）（Sigma-Aldrich，目录号：34850-2.5L）
甲酸铵（NH 4 HCOO）（VWR，目录号：17843-50G）
乙腈（CH 3 N CN）（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：9012-03）
Millipore超纯水（高压灭菌）
Bacto TM 酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212720）
Bacto TM 胰蛋白胨（BD，Bacto TM ，目录号：211699）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434-5KG-R）
丙-2-醇（Sigma-Aldrich，目录号：34863-2.5L-M）
甲酸（HCOOH）（VWR，目录号：56302-50ML）
氢氧化钠（NaOH），1N（VWR，目录号：31627.290）
中等Luria Bertani（LB）肉汤（见食谱）
LC-MS校准物（10mM甲酸钠）（参见食谱）
HPLC缓冲液A（参见食谱）

设备

1000毫升锥形瓶与chicane
100毫升锥形瓶与chicane
振荡器（设定在160rpm）（Eppendorf，New Brunswich TM ，型号：Excella ® E10）
移液器控制器（BrandTech Scientifc，型号：accu-jet ® pro）
微量离心机（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Heraeus TM Pico TM 17）
中型台式离心机（Thermo Fischer Scientific，型号：Heraeus TM Biofuge Pico）
细胞密度计（Biochrom，型号：Biochrom WPA CO8000）
细胞破坏器（GMI，型号：Thermo Savant FastPrep 120）
旋转式真空浓缩机（Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen，型号：RVC 2-18 CDplus）
Gemini ® 5μm110Å，150 x 4.6 mm LC色谱柱（Phenomenex，目录号：00F-4435-E0）
质谱仪（Bruker，型号：micrOTOF焦点二）
高性能液相色谱（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Ultimate TM 3000 / RS）

软件

Chromeleon Xpress（Dionex）
MicroTOF控制版3.0（Bruker Daltonics）
Bruker Compass HyStar版本3.2（Bruker Daltonics）
指南针数据分析版本4.0（Bruker Daltonics）
MetaboliteDetect 2.0（Bruker Daltonics）
GraphPad Prism 6（San Diego，CA，USA）

程序

细菌生长
1. 将20ml LB培养基加入到具有chicane的100ml锥形瓶中
2. 接种具有单个殖民地的LB肉汤培养基。大肠杆菌野生型和Δ琼脂生长在琼脂平板上，其前一天被划痕。
3. 在37℃和160rpm下生长细菌16小时。
4. 测量过夜培养物的OD 600nm（野生型的预期OD为3.5和MurQ）。
5. 加入200毫升LB培养基至1,000毫升锥形瓶
6. 接种200ml含有细菌的LB培养基以获得0.05的初始OD 600nm。
7. 生长3小时后，预计细菌达到1.76的OD 600nm
产生细菌胞质级分
1. 在室温下将3,000ml（相当于100ml OD 3的体积）的细菌悬浮液（4×50ml Falcons）以3,000×g旋转10分钟。
2. 小心地将细菌沉淀在20ml Millipore水中。避免涡旋的细菌悬浮液，以防止细胞裂解。
3. 在室温下以3,000×g将细菌分解10分钟
4. 弃去上清液，并立即在-80℃冷冻颗粒。样品在第二天或-80°C储存后一周内进一步进行。
5. 在室温下将冷冻样品解冻，并将Millipore水中的沉淀重新悬浮至最终体积为1.2ml
6. 用杯子将0.25g玻璃珠加入到微管中
7. 将1.2ml细菌悬浮液转移到带玻璃珠的微管上
8. 使用细胞破坏剂将细胞与玻璃珠分解（4x，速度为35秒，速度为6）。第二个循环后，在冰上冷却细胞1分钟
9. 将微量离心机中的样品以16,000 x g在室温下旋转10分钟。
10. 将200μl上清液加入800μl冰冷的丙酮中，将样品中的剩余蛋白质沉淀在2 ml微管中，倒置3次。
11. 在室温下以16,000×g离心样品10分钟，并将上清液转移到新的2ml微管中。
12. 在55℃真空干燥细胞质级分2小时并储存在4℃。
13. 在LC-MS测量之前，将细胞溶质级分溶解于100μlMillipore水中
14. 将5μl每个样品注入LC柱，预先用缓冲液A（0.1％甲酸，0.05％甲酸铵）平衡。
LC-MS程序
1. 使用MicrOTOF生成控制MS程序，应用质量范围为80到3,000 m / z 。
2. 使用10mM甲酸钠校准物校正MS在负离子模式
3. 用Bruker Compass HyStar生成45分钟HPLC梯度程序：

数据分析

E-E的HPLC-MS数据。使用指南针数据分析分析大肠杆菌野生型（WT）和ΔhIQQ突变体样品。数据显示为负离子模式下的基峰峰值色谱图（BPC），其质量要达到80至3000的质量（m / z / em）范围。产生差示离子谱（DS），使用程序代谢检测法和差异因子5从BPC中减去野生型BPC（图1），差异因子为5.DS显示主要在保留时间为19.8至22.7分钟时细胞内代谢物水平的差异（图1）。在该保留时间的DS包含对应于MurNAc-6P（（MH））的负离子模式的离子，MurNAc-6P的消除产物（282.039m / z）和MurNAc-6P二聚体（745.148m / z）（图2）。此外，使用指南针数据分析工具生成MurNAc-6P（（M-H）的提取离子色谱图（EIC）= 372.070m / z）。 MurNAc-6P的EIC曲线下面积（AUC）使用Prism 6程序确定，基线设置为30（图3）。结合标准曲线分析MurNAc-6P的EIC的AUC可以用于量化在ΔmurQ突变体中积累的MurNAc-6P的量（Borisova等人，，2016）。

图1. WT和Δ突变细胞的可溶性提取物的HPLC-MS分析。基本峰色谱图BPC）显示出类似的代谢物模式，其差异可以通过计算差示离子谱（DS）来显现

图2.图1中19.8至22.7分钟的差示离子谱（DS）信号的质谱。该化合物通过其确切质量（（MH））识别为MurNAc-6P，观察到= 372.071m / z，理论值= 372.070m / z，）二聚物的精确质量（745.148m / z >）和消除产品（282.039 m / z ）

图3. MurNAc-6P的提取离子色谱图（EIC）。搜索MurNAc-6P的372.071 m / z 的EIC显示野生型（WT）细胞（中断的黑线）没有信号，但是对于ΔmurQ < / 突变细胞（蓝线;上图）。后一个信号曲线下面积（AUC）允许使用已知浓度的MurNAc-6P标准（下图）（Unsleber等人，2017）量化MurNAc-6P的量。

笔记

只能使用HPLC级化学品和超纯的Millipore水进行样品制备和质谱分析。
用Millipore水广泛洗涤细菌培养物，以消除LB肉汤培养基中盐和成分的污染
避免在洗涤期间细菌悬浮液涡旋以防止细胞裂解。
在-80℃下冻结细菌培养物，以改善玻璃珠随后的细胞破坏
在LC-MS测量之前，使用冰冷的丙酮有效沉淀胞质部分中剩余的蛋白质
以负离子模式进行MurNAc-6P的检测。在正离子模式下无法检测到MurNAc-6P。

食谱

中等Luria-Bertani（LB）肉汤，米勒
5克酵母提取物
10克胰蛋白胨
10g氯化钠
在1升蒸馏水中高压灭菌介质在121°C 15分钟
LC-MS校准物（10mM甲酸钠）
12.5毫升Millipore水
12.5毫升丙-2-醇
50微升甲酸
250μl1N NaOH
HPLC缓冲液A：0.1％甲酸，0.05％甲酸铵（pH3.2） 1毫升甲酸
0.5g甲酸铵
1升高压灭菌的Millipore水

致谢

该协议由Borisova等人（2016）进行了改编。 Christoph Mayer得到德意志银行（DFG）授权MA2436 / 7，SFB766 / A15和GRK1708 / B2的支持。

参考

Borisova，M.，Gaupp，R.，Duckworth，A.，Schneider，A.，Dalugge，D.，Mühleck，M.，Deubel，D.，Unsleber，S.，Yu，W.，Muth， Bischoff，M.，Götz，F.和Mayer，C.（2016）。＆nbsp; 革兰阳性菌中的肽聚糖回收对于稳定期的生存至关重要。 7（5）。

Jaeger，T.，Arsic，M.和Mayer，C。（2005）。通过大肠杆菌“醚酶”分离出N-乙酰谷氨酸的乳糖醚键。 280（34）：30100-30106。

Litzinger，S.，Duckworth，A.，Nitzsche，K.，Risinger，C.，Wittmann，V. and Mayer，C。（2010）。枯草芽孢杆菌中的神经肽拯救涉及β-氨基葡糖苷酶的顺序水解， N-乙酰月桂酰-L-丙氨酸酰胺酶。 J Bacteriol 192（12）：3132-3143。

Reith J.和Mayer，C.（2011）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21796380”target =“_ blank” >革兰氏阳性菌中的肽聚糖周转和回收利用。 Appl Microbiol Biotechnol 92（1）：1-11。

Uehara，T.，Suefuji，K.，Jaeger，T.，Mayer，C.and Park，JT（2006）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：//www.ncbi.nlm .nih.gov / pubmed / 16452451“target =”_ blank“>大肠杆菌所要求的MurQ醚酶为了代谢获得的脱氢-NH-乙酰木瓜霉糖酸环境或其自身的细胞壁。 J Bacteriol 188（4）：1660-1662。

unsleber，S.，Borisova，M.和Mayer，C.（2017）。＆nbsp; 酶的合成和半制备型分离的N-乙酰谷氨酸6-磷酸酯。碳水化合物445：98-103。