材料和试剂

移液器提示
10μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.1130）
200μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.760.002）
1,000μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.762）
反应管
1.5ml管（SARSTEDT，目录号：72.706）
2毫升管（SARSTEDT，目录号：72.691）
小鼠（方案已经测试了雄性和雌性C57Bl / 6小鼠8-52周）
氯化钠（NaCl）（≥99.5％）（Carl Roth，目录号：3957）
Tris（≥99.9％，p.a.）（Carl Roth，目录号：4855）
蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete TM 不含EDTA的EasyPack）（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma-Aldrich，目录号：P0044）
十二烷基硫酸钠（SDS）（≥99.5％）（Carl Roth，目录号：2326）
Benzonase（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）
裂解缓冲液（见配方）
2％SDS（参见食谱）

设备

移液器（研究0.5-10μl，10-100μl，100-1,000μl）（Eppendorf）
玻璃均化器（2ml）（Carl Roth，目录号：TT57.1）
铁氟龙杵（Carl Roth，目录号：TT63.1）
搅拌装置（IngenieurbüroCAT M.Ziperer，型号：R 50D）
Heraeus Biofuge Stratos（转子）（Heraeus Holding，目录号：3332）
超声波超声波发生器（艾默生电气，BRANSON，型号：150）

程序

注意：

已经使用以下方案从阿尔茨海默病小鼠模型的小鼠脑和脊髓样品中提取可溶性和不溶性蛋白质级分（参见Härtig等人[2014]和Saul and Wirths [2017]）。用户可能需要根据具体的下游应用（例如，Western印迹或ELISA）来修饰溶液的量（例如裂解缓冲液）。对于蛋白质印迹，我们建议每孔使用20至50μg的总蛋白。该方法将产生可溶性蛋白质级分，浓度约为2-4μg/μl和SDS-可溶级分5-8μg/μl。根据初始组织重量，蛋白质量> 2mg（可溶性级分）和＆gt;通常可以实现4mg（SDS-可溶性级分）。
对于小鼠脑和/或脊髓制备，通过CO 2 2将动物麻醉，并通过颈脱位处死。小心切开组织，直接使用或保存在-80°C直至进一步使用。

组织匀浆
1. 使用冷裂解缓冲液（每100 mg组织700μl缓冲液，参见食谱），在玻璃 - 特氟隆匀浆器中用10次冲洗，以重量：体积比为1:7，以机械方式匀浆新鲜或深冻的脑或脊髓组织（图2）在800rpm（图3A和3B）。匀浆应具有乳白色外观，无可见颗粒。
  注意：我们的实验室使用一个脑半球，小脑和嗅球去除，并在一块干冰上快速冷冻。我们在收集组织时不要去除脑膜。
  
  图2.电动均质器
  
  图3.示出不同匀化和离心步骤的示例图像
蛋白质提取
1. 将整个匀浆转移到1.5ml反应管中（图3C）。
2. 在4℃下将样品以17,000 x g 旋转20分钟。
  注意：离心机应预冷至4°C。
3. 去除上清液（可溶性级分），并储存在-80°C直到进一步使用（图3D）
4. 通过在冰上超声处理，用几个短的超声脉冲将颗粒1（图3E）重悬于800μl（脑半球）或200μl（脊髓）2％SDS中（参见食谱）。这种处理时颗粒应溶解（图3F）注意：我们使用约5个短的超声波脉冲。在1.5ml反应管中，在2级的1秒长度。透明的SDS溶液会变浊。小心防止泡沫形成。
5. 加入1μlBenzonase，轻轻混匀，室温孵育5 min，去除DNA
6. 在4℃下将样品以17,000 x g 旋转20分钟。
7. 将上清（不溶性级分）转移到新鲜的1.5ml反应管中，并储存在-80℃直至进一步使用（图3G）。
8. 颗粒2可以储存在-80℃以进一步提取，例如使用甲酸。

数据分析

通过该方案获得的蛋白质级分可以进一步用于下游应用如蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定（ELISA）（例如，在Western印迹中可能进一步使用的一个例子见Härtig等人，2014年;扫罗和温斯，2017年）。

食谱

裂解缓冲液
120 mM NaCl
50 mM Tris
cOmplete TM 蛋白酶抑制剂混合物（1片每10ml）
磷酸酶抑制剂混合物3（以1:100稀释使用）
调整至pH 8.0
注意：可以在4°C储存1个月，或在-20°C储存3个月。
2％SDS
将1g SDS溶解于10ml ddH 2 O中，并制备1:5稀释度注意：SDS由易分散的细晶体组成。称重SDS后戴上面具，彻底清洁设备。

致谢

阿尔茨海默氏福祉计划e.V.的财政支持非常感谢。

参考

Härtig，W.，Saul，A.，Kacza，J.，Grosche，J.，Goldhammer，S.，Michalski，D.and Wirths，O。（2014）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23566195”target =“_ blank”>免疫激素诱导的胆碱能投射神经元的损失促进三重转基因小鼠海马中的β-淀粉样变性和tau高磷酸化。 Neuropathol Appl Neurobiol 40（2）：106-120。
Saul，A.和Wirths，O.（2017）。＆nbsp; 内源性载脂蛋白E（ApoE）断裂与阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的淀粉样蛋白病理学有关。 Mol Neurobiol 54（1）：319-327。