材料和试剂

移液器提示
10μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.1130）
200μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.760.002）
1,000μl移液器吸头（SARSTEDT，目录号：70.762）
反应管
1.5ml管（SARSTEDT，目录号：72.706）
2毫升管（SARSTEDT，目录号：72.691）
小鼠（方案已经测试了雄性和雌性C57Bl / 6小鼠8-52周）
蔗糖（≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
HEPES（≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete TM 不含EDTA的EasyPack）（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
磷酸酶抑制剂混合物3（Sigma-Aldrich，目录号：P0044）
氯化钠（NaCl）（≥99.5％）（Carl Roth，目录号：3957）
氯化钾（KCl）（≥99％）（Carl Roth，目录号：P017）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（≥98％）（Carl Roth，目录号：P030）
二氢磷酸氢钾（KH 2 PO 4）（≥99％）（Carl Roth，目录号：3904）
裂解缓冲液（pH 7.5）（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

移液器（研究0.5-10μl，10-100μl，100-1,000μl）（Eppendorf）
Heraeus Biofuge Stratos（转子）（Heraeus Holding，目录号：3332）
超声波超声波发生器（艾默生电气，BRANSON，型号：150）
搅拌装置（IngenieurbüroCAT M.Ziperer，型号：R 50D）
玻璃均化器（2ml）（Carl Roth，目录号：TT57.1）
铁氟龙杵（Carl Roth，目录号：TT63.1）

程序

注意：

已经使用以下方案从阿尔茨海默病小鼠模型的小鼠脑样品中提取粗突触体和游离线粒体部分（参见Breyhan等人[2009]和Saul and Wirths [2017]）。用户可能需要根据颗粒下游应用（例如，Western印迹或ELISA）来修饰溶液的量（例如裂解缓冲液）。对于蛋白质印迹，我们建议每孔使用20至50μg的总蛋白。该程序将产生浓度约为的粗突变体级分。 7-10μg/μl，微粒体和可溶性酶组分约为4-6μg/μl。
对于小鼠脑准备，将动物用二氧化碳（CO 2 >）进行麻醉，并通过颈脱位处死。小心切开组织，直接使用或保存在-80°C直至进一步使用。如果使用新鲜或冷冻的组织，蛋白质组分的产量或质量没有差异。

使用冷裂解缓冲液（每100毫克组织1,000μl缓冲液，参见食谱），以玻璃 - 特氟龙匀浆器（800 rpm）10次冲洗，以重量：体积比1:10，以机械方式匀浆新鲜或深冻的脑半球（图2 ）。
注意：我们的实验室使用一个脑半球与小脑和嗅球去除，并在一块干冰上快速冷冻，然而小脑或嗅球的存在不会影响手术。为了方便起见，我们不会在收集纸巾时清除脑膜。

图2.电动均质器
将匀浆转移到1.5ml反应管中
在4℃下将样品以1,000×g旋转10分钟以分离核（颗粒P1）。
注意：离心机应预冷至4°C。
去除上清液（S1）并转移到新的1.5ml反应管中。颗粒（P1）可以被丢弃。
在4℃下将上清液以12,000×g旋转10分钟，将含有轻质膜部分和可溶性酶的所得上清液（S2）转移到新的1.5ml反应管中。
将含有粗突触体和线粒体的沉淀（P2）重悬于500μlPBS（见配方）。
均质剂可以储存在-80°C直到进一步使用。

数据分析

通过使用该方案获得的蛋白质级分可用于下游应用，如Western印迹。通过使用标记蛋白如突触后密度蛋白95（PSD95）或细胞色素c氧化酶（CoxIV）（Saul和Wirths，2017）的蛋白质印迹分析证明，粗突触体和线粒体的成功富集可以是例如（图3）

图3.使用具有β-肌动蛋白作为载体对照的PSD95和COXIV的抗体的示例性Western印迹

食谱

裂解缓冲液（pH 7.5）
0.32 M蔗糖
5 mM HEPES
cOmplete TM 蛋白酶抑制剂混合物（1片每10ml）
磷酸酶抑制剂混合物3（以1:100稀释使用）
注意：可以在4°C储存1个月，或在-20°C储存3个月。
PBS（1x工作溶液pH 7.4）
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
8mM Na 2 HPO 4
2mM KH PO 4

致谢

阿尔茨海默氏福音计划e.V.的财政支持非常感谢。该协议改编自Gurd等人（1974）进行修改。

参考

Breyhan，H.，Wirths，O.，Duan，K.，Marcello，A.，Rettig，J.and Bayer，TA（2009）。＆nbsp; APP / PS1KI bigenic小鼠发生早期突触缺陷和海马萎缩。神经酰胺Acta Neuropathol 117（6）：677-685。

Gurd，JW，Jones，LR，Mahler，HR和Moore，WJ（1974）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4364339 “target =”_ blank“>大鼠脑突触细胞膜的分离和部分表征。 Neurochem 22（2）：281-290。

Saul，A.和Wirths，O.（2017）。＆nbsp; 内源性载脂蛋白E（ApoE）片段化与阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的淀粉样蛋白病理学相关。 Mol Neurobiol 54（1）：319-327。