材料和试剂

细胞培养皿：35×10mm（Corning，目录号：430166）
15ml离心管（Corning，目录号：430790）
Tipone ®移液器技巧（USA Scientific，目录号：1126-7810）
5 ml移液管（Corning，Falcon ®，目录号：357543）
2 ml冷冻保存瓶（Corning，目录号：430659）
酒精预处理垫（PDI，目录号：B33905）
动物：2至4周龄小鼠
Worthington木瓜蛋白酶试剂盒（木瓜蛋白酶解离系统）（Worthington Biochemical，目录号：LK003150）
注意：试剂盒的组分包括小瓶1（无菌Earle的平衡盐溶液，EBSS），小瓶2（含有L-半胱氨酸和EDTA的木瓜蛋白酶），小瓶3（脱氧核糖核酸酶I，DNA酶）和小瓶4（卵泡蛋白酶抑制剂用牛血清白蛋白）。
70％乙醇
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
青霉素 - 链霉素（Pen / Strep）（10,000μg/ ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Mediatech，Cellgro ，目录号：10-013-CV）
胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30071.03）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890-100G）
0.25％胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-053-CI）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
细胞培养基（参见食谱）
0.1％明胶溶液（见配方）
细胞冷冻培养基（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf）
吸管（Drummond）
单刃刀片（Sparco，目录号：SPR11820）
解剖钳和剪刀

虹膜剪刀夏普直（Storz Ophthalmic Instruments，目录号：E3344）
Castroviejo缝合钳0.12 mm（Storz Ophthalmic Instruments，目录号：E1796）

37℃，5％CO 2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：3250型）
37℃培养箱（VWR，型号：1545）
Allegra台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
实验室地震烤架（Barnstead Thermolyne LabQuake，型号：4152110）
倒置常规显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TS100）
立体声双目显微镜（Olympus，型号：SZ40）
注意：小鼠通过二氧化碳窒息，二氧化碳源，调节分配器和安乐死室来安乐死。所有动物操作均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的政策和指南进行，由美国肯塔基州路易斯维尔路易斯维尔大学批准。

程序

木瓜蛋白酶解离系统的制备
1. 根据制造商的说明准备Worthington木瓜蛋白酶包。
2. 将32ml EBSS（小瓶1）加入到白蛋白卵类粘蛋白抑制剂混合物（小瓶4）中。完全溶解，然后储存在4°C冰箱中，并在1周内使用
3. 向木瓜蛋白酶瓶（小瓶2）中加入5ml EBSS（小瓶1），将小瓶2置于37℃培养箱（或水浴）中10分钟，或直到木瓜蛋白酶完全溶解。
4. 将500μlEBSS（小瓶1）加入DNase小瓶（小瓶3），轻轻混匀，然后加入250μl混合物至步骤A3保存的木瓜蛋白酶2。剩余的250μl将用于步骤C，步骤C5。
5. 将上述混合的小瓶2转移到15ml锥形离心管中
小鼠眼睛解剖
1. 用70％乙醇消毒解剖镊子和剪刀，并将其烧干。
2. 准备含有2ml PBS和1％青霉素 - 链霉素的三个皿，并用数字标记，如图1所示。
  
  图1.准备三个菜肴，并用数字
  标记
3. 至少2只小鼠被CO 2窒息安乐死，然后置于无菌手术垫上。用70％酒精制备垫消毒眼睑表面。
4. 通过沿插座插入镊子直到光学神经束，并将其置于第一道中10分钟（图2A），提取具有光束的鼠标眼球。
5. 在立体双眼显微镜下，小心地取出第一盘中眼球周围的肌肉，筋膜和结膜组织，然后将其转移到第二道菜（图2B，视频1）。
6. 眼球解剖：去除眼睛的前部，包括角膜，虹膜和镜片，将后眼杯保留在第二道碟中（图2C，视频1）。
7. 从剩余的后眼中，视网膜在第三个盘中被解剖为没有视网膜色素上皮（RPE）（图2D，视频1）。
  
  图2.眼球解剖。将摘除的小鼠眼球首先浸入PBS中，用抗生素进行消毒（A）;然后转移到第二个盘（B）以除去最前面的眼组织（C），并分离第三个盘（D）中的视网膜。
  
  视频1
Müller细胞的分离和培养
1. 将视网膜置于15 ml锥形离心管中，包含在步骤A5保存的木瓜蛋白酶和DNA酶溶液。用单边刀片将视网膜切成小块（图3A）。
2. 将含有组织的管在37℃的培养箱中孵育，用恒定的振荡器轻轻摇动60分钟直到溶液变澄清（图3B）。
  
  图3.孵化前培养基变得混浊（A），大部分视网膜在孵育后消失（B）
3. 用5ml移液管研磨混合物2-3次。允许任何未消化的组织残留物沉淀到管的底部。
4. 小心地将混浊细胞悬浮液转移到15-ml锥形离心管中，并在室温下以300×g离心5分钟。在此期间，准备细胞培养基以重悬细胞沉积
5. 将无菌管中的培养基与2.7ml EBSS（小瓶1）混合，在步骤A2保存的300μl重构白蛋白 - 卵类粘蛋白抑制剂溶液（小瓶4），在步骤A4保存的150μlDNA酶溶液（小瓶3）。
6. 弃去上清液，然后通过在步骤C5中加入培养基混合物立即重悬细胞沉淀
7. 将5.0ml白蛋白抑制剂溶液（小瓶4）加入到离心管中，小心地将细胞悬液置于顶部，然后在室温下以70×g离心6分钟。两层梯度之间的界面应清晰可见。分离的细胞沉淀位于管的底部，而膜片段保留在界面处
8. 弃去上清液，立即将沉淀的细胞重悬于具有10％胎牛血清（FBS）和1％Pen / strep抗生素（见食谱）的培养基（DMEM）中。
9. 准备100毫升0.1％的明胶在PBS中（参见食谱），加入1毫升或足以覆盖35毫米皿的底部以覆盖表面，将盖子盖在37℃的细胞培养箱超过30分钟，吸出涂层溶液，涂层盘即可使用。
10. 将解离的细胞收集并在5.5％CO 2的上述明胶包被的培养皿中培养。传代前的原代细胞（P <0>）实际上是Müller细胞，感光细胞和其他视网膜神经元的混合物。
11. 电镀后，贴壁细胞在37℃下保持7天。培养基每5天更换一次，直到细胞融合并以1：1的比例传播到涂有0.1％明胶的新鲜培养皿中（图4A）。粘附的Müller神经胶质细胞在通过细胞形态和用谷氨酰胺合成酶（GS，Müller胶质细胞标记物）的免疫染色鉴定的2至3代之后变得相对纯净（图4B）。
  
  图4.一次传代（A）培养10天后的小鼠Müller单层细胞，培养的细胞用Müller细胞特异性标志物GS（B） >
液氮中的细胞冷冻保存
1. 从汇合单层培养皿中取出培养基
2. 用PBS在室温下冲洗两次。
3. 将0.75ml或2ml 0.25％胰蛋白酶溶液分别加入到6cm或10cm的培养皿中，或足够的量覆盖单层。
4. 在37℃的培养箱中孵育1-2分钟，直至细胞从盘子上轻轻地打到台面边缘后才能脱落。
5. 加入含有10％FBS的培养基，加入胰蛋白酶的2-3倍，轻轻混匀一分钟，转移至15 ml管中。
6. 以500xg离心10分钟以收集细胞沉淀。
7. 弃去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在1-3ml细胞冷冻培养基中（参见食谱）（通常每2×10 5个细胞1ml）。
8. 等分成2ml冷冻保存小瓶。
9. 将小瓶置于-20°C冷冻箱中1天，然后转移至-80°C 1天，最后储存在液氮罐中长期储存。

数据分析

使用上述方法，通过以大约1：1的比例连续传代原代细胞，直到第6代（P6），当大多数细胞表现出应激反应时，我们成功地获得了从4只C57BL / 6小鼠（共8只眼睛杯）分离的大量Müller细胞，诱导早衰（SIPS）表型大，平坦，具有明显的异染色质核心核，对β-半乳糖苷酶活性呈阳性。这些衰老的Müller细胞不是增殖的，但是如果保持中和时间更新，可以在文化中长时间存活，但最终在3-4个月内死亡。如果不使用月份，细胞应保存在液氮罐中以进行长期储存，并且可以通过在37℃水浴中直接解冻冷冻的细胞小瓶来回收，然后以较少的活力损失将细胞接种在培养物中。 Müller细胞纯度的百分比不同于通过，因为其他视网膜神经细胞在这样的培养条件下不能存活。估计2次通过后的纯度大于95％。

笔记

所有组织和细胞操作必须处于无菌状态，或者在组织切除或细胞培养罩中，用70％乙醇表面消毒。
我们强烈建议从同一只小鼠一起收集和解剖两个眼球，并分离和培养Müller细胞与其他小鼠分开，以尽可能减少交叉污染。
原代细胞包括Müller细胞，感光细胞和其他神经元。光感受器和其他神经元细胞不能适应贴壁培养，并且会在第2代后出现凋亡（P 2 ）。
用培养皿特异性地涂上0.1％明胶，以使Müller细胞更好地粘附。

食谱

细胞培养基
Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）
10％胎牛血清（FBS）
1％青霉素 - 链霉素（Pen / Strep）
0.1％明胶溶液
100ml dH 2 O加0.1g明胶，高压灭菌
细胞冷冻培养基
Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）
20％胎牛血清（FBS）
1％青霉素 - 链霉素（Pen / Strep）
10％二甲基亚砜（DMSO）

致谢

该方案最初在猪实验室采用（Xu等人，2017），现在修改为小鼠。这项工作得到了国立普通医学科学研究所（P20GM103453至Y.L。），路易斯维尔医学院（E0819至Y.L。）和防止失明研究（对路易斯维尔的眼科和视觉科学系）的支持。

参考

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De Melo Reis，RA，Ventura，AL，Schitine，CS，de Mello，MC and de Mello，FG（2008）。＆nbsp; Müller胶质细胞作为调节脊椎动物视网膜神经活动的活性隔室：神经递质和营养因子。 Neurochem R 33：1466-1474。

Fischer，AJ和Reh，TA（2001）。＆nbsp; Müller胶质神经胶质是出生后视网膜神经再生的潜在来源。 Nat Neurosci 4：247-252。

Sarthy，PV and Lam，DM（1978）。＆nbsp; 生化研究来自乌龟视网膜的孤立胶质细胞（Müller）。细胞生物学78（3）：675-684。

Vihtelic，TS和Hyde，DR（2000）。＆nbsp; Light诱导的杆和锥细胞在成年白血病斑马鱼（Danio rerio）视网膜中的死亡和再生。 J Neurobiol 44（3）：289-307。

Xu，N.，Chen，Y.，Dean，KC，Lu，X.，Liu，X.，Wang，W.，Dean，DC，Kaplan，HJ，Gao，L.，Dong，F.and Liu，Y 。（2017）。猪圈和猪圈的复活人乳头状胶质细胞主要是由端粒伸长引起的。干细胞 25（6）：1579-1591。