材料和试剂

移液器吸头（VWR）
12孔板（Corning，Falcon ®，目录号：353043）
100毫米组织培养皿（康宁，Falcon ®，目录号：353803）
Amicon Ultra 15过滤装置3K（EMD Millipore，目录号：UFC900308）
（VWR，目录号：89000-028）
50ml Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
1 ml注射器（Terumo Medical，目录号：SS-01T）
30 G针（BD，目录号：305128）
Flp-In T-rex 293细胞系（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：R78007）（可选）
pcDNA5 FRT TO（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：V652020）（可选）
潮霉素B（NACALAI TESQUE，目录号：07296-11）（可选）
杀稻瘟菌素（Wako Pure Chemical Industries，目录号：029-18701）（可选）
多西环素（Takara Bio，Clontech，目录号：631311）（可选）
Dulbecco改良的老鹰培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D6546）
胎牛血清（FBS）（Biosera，目录号：FB-1345/500）
抗Flag M2琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15070063）
乙酸钾（KAc）（Sigma-Aldrich，目录号：236497）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
3xFlag肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
生长培养基（见食谱）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

移液器（例如，，Gilson）
37℃，5％CO 2培养箱（例如，Panasonic Biomedical，目录号：MCO-170AICUV-PE）
位于冷室中的管旋转器（例如，Fisher Scientific，目录号：88-861-049）
离心机（例如，，Eppendorf，型号：5804）
细胞培养显微镜（例如，，Carl Zeiss，Vienna，Austria）

程序

使用Flp-In T-rex 293细胞系生成稳定的细胞系（图1）
注意：Flp-In T-rex 293细胞系适用于您感兴趣的3xFLAG标记的蛋白质的诱导型，稳定和均匀的高表达。只要转染效率（通过免疫荧光测定）超过50％，可以使用瞬时转染的细胞系。

图1.如何制备稳定的Flp-in T-rex 293细胞系图。用质粒转染Flp-in T-rex 293细胞（pcDNA5 FRT TO与感兴趣的基因和含有翻转酶基因的pOG44）。第二天，用潮霉素B培养细胞以选择在基因组区域的FRT位点掺入感兴趣的基因的细胞。多克隆稳定细胞系是均一的表达
1. 12孔板各孔中的1×10 5个Flp-In T-rex 293细胞。
2. 当细胞达到约50％的融合时孵育过夜，并转染具有pcDNA5 FRT TO的Flp-In T-rex 293细胞，其含有您的FLAG标记的基因和pOG44质粒。
3. 转染4-5天后，用100μg/ ml潮霉素B和15μg/ ml杀稻瘟素处理细胞约2周。
FLAG标记蛋白的纯化
1. 在补充有10μg/ ml多西环素的生长培养基（见食谱）中培养长达五个100毫米的Flp-In T-rex 293细胞的Flp-In T-rex 293细胞，表达3xFLAG标记的蛋白质，直到细胞约80％汇合。
2. 将细胞培养基更换为含有10μg/ ml多西环素的含有5％FBS的10ml DMEM，培养2天。
  注意：在浓缩步骤中，10％FBS培养基可能会堵塞Amicon离心机过滤器。
3. 将细胞培养基（条件培养基）从步骤B2的所有五个100mm的培养皿中收获到50ml的Falcon管中。
4. 将条件培养基以2,000 x g离心5分钟，4℃
5. 将上清液转移到Amicon离心机过滤器单元中。旋转4,000 x g 30-40分钟。
6. 重复步骤B5直到保留体积小于2毫升。
7. 将浓缩的条件培养基转移到两个1.5ml管中（每管1ml）
8. 向每个管中加入100μl预洗的50％FLAG M2珠浆料。
9. 在4℃下旋转时，至少孵育2小时。
10. 用0.5ml冷洗涤缓冲液洗涤珠子（参见食谱）4次，以100×g旋转1分钟。最后一次洗涤后，尽可能多地使用缓冲液，用注射器针头尽可能少地破坏珠粒。
11. 用0.2ml洗脱缓冲液（见食谱）将小珠孵育1小时，并离心后收集纯化的FLAG标记的蛋白质。

食谱

生长培养基（560.5ml）
500毫升DMEM
55毫升10％FBS
5.5 ml 1％青霉素 - 链霉素
洗涤缓冲液（50ml）
5.5 ml 1 M KAc（110 mM）
1 ml 1 H HEPES（pH 7.4）（20 mM）
100μl1M MgCl 2（2mM）
用Millipore水补足50毫升
洗脱缓冲液（210μl）
10μl5mg / ml 3xFlag肽（0.25mg / ml）
200μl1x PBS

致谢

该方案由Chen等人改编（2017）。这项工作得到JSPS KAKENHI（Young Scientists A）授权号16H06167，MEXT KAKENHI（创新地区科学研究）授权号16H01194（授予E.I.）的支持。欧洲分子生物学组织奖学金（至C.C.）;英国医学研究理事会和欧洲研究理事会（Advanced Grant 269058）授予M.d.B.

参考

Chen，C.，Itakura，E.，Nelson，GM，Sheng，M.，Laurent，P.，Fenk，LA，Butcher，RA，Hegde，RS and de Bono，M。（2017）。 =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28099418”target =“_ blank”> IL-17是秀丽隐杆线虫感觉的神经调节剂回复。自然 542（7639）：43-48。