材料和试剂

物料

1.7ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
15 ml管（Corning，目录号：430052）
PCR管（Corning，Axygen ，目录号：PCR-0208-C）
移液器提示

细菌菌株

（rB-，mB- ）gal gal a a a
电能NEB5α（New England Biolabs）

噬菌体

WT T7噬菌体（实验室收集，可在ATCC，目录号：BAA-1025-B2）

质粒

pUC19（Yanisch-Perron等人，1985）
pWUR397（Brouns等人，2008，T7启动子下的cas3，Kan R ）
pWUR400（Brouns等人，2008，T7启动子下的级联基因，Str R ）
pWUR477（Brouns等人），2008年。在T7启动子下，用对照间隔基克隆的pACYCDuet-1（Novagen），cam / sup> R /

酶

限制性内切酶（New England Biolabs，目录号：R0176S）
与T4 DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202S）一起使用的T4多核苷酸激酶（New England Biolabs，目录号：M0201S）

套件

凝胶和PCR清除试剂盒（MACHEREY-NAGEL，目录号：740609.50）
KAPA HiFi PCR试剂盒（Roche Diagnositics，目录号：07958935001）
Lamda Taq PCR Master mix（Lamda Biotech，目录号：D123P-200）
快速连接试剂盒（New England Biolabs，目录号：M2200L）

试剂

琼脂（BD，Difco TM ，目录号：214010）
氨苄青霉素（Merck，目录号：171254;在双蒸水中储存100毫克/毫升，过滤，-20℃）
氯霉素（Merck，目录号：220551;在乙醇中储存35mg / ml，过滤，-20℃）
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Bio-Lab，目录号：16242352;在双蒸水中储存1M，过滤，-20℃）
卡那霉素（Merck，目录号：420311;在50％甘油和双蒸水中储存50mg / ml，过滤，-20℃）
L-阿拉伯糖（Gold Bio，目录号：A-300-1;在双蒸水中储存20％，过滤，RT）
LB（Luria-Bertani）培养基（10g / L胰蛋白胨，5g / L酵母提取物和5g / L NaCl）（Acumedia）
分子生物学水（Bio-Lab，目录号：232123）
PEG 8000（聚乙二醇）（Promega，目录号：V3011;在双蒸水中储存50％，过滤，RT）
链霉素（EMD Millipore，目录号：5711;在双蒸水中储存50mg / ml，过滤，-20℃）
TAE缓冲液（Bio-Lab，目录号：20502323）

LB培养基（参见食谱）
LB琼脂平板（参见食谱）
软琼脂（见食谱）
TAE缓冲区（见配方）

设备

细胞密度计（OD 600读数器）（Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 10）
电穿孔装置（Bio-Rad Laboratories，型号：MicroPulser TM ）
凝胶电泳仪（Cleaver Scientific，型号：MultiSUB Choice）
微型离心机（Eppendorf，型号：MiniSpin ®）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 2000c）
移液器
振荡器（对于50ml管，在37℃下）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific＆amp; TM，型号：MaxQ TM 2000）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：C1000 Touch TM ）
Thermoblock（Labnet International，型号：AccuBlock TM Digital Dry Baths）

程序

质粒构建
1. pGeneX的构建
  该质粒编码与目标遗传基因座的上游和下游序列同源的DNA。这些DNA将与所需的基因座重组，从而产生所需的重组噬菌体（图1）。
2. pAnti-GeneX的构建
  该质粒编码用于靶向未修饰的噬菌体的特异性间隔物，从而能够选择经修饰的噬菌体。
  1. 使用具有5'突出端的引物，以pWUR477质粒作为模板进行PCR扩增反应，在连接时形成新的间隔基。见下图2
    
    注意：最小反应体积为30μl。
    
    图2. pAnti-GeneX构建体的示意图。A.产生靶向基因X的间隔物的引物设计的实例。靶向的DNA是粉红色的。该原始样品是感兴趣的基因中的一个33bp的序列，之前是一个AA，产生一个功能性原始相邻基序（PAM）。正向和反向引物编码pWUR477模板的退火序列和一起形成所需间隔序列的5'突出端。 B.使用正向和反向引物对pWUR477质粒进行PCR扩增，并自连接构建pAnti-GeneX质粒。灰色矩形表示重复序列，粉红色代表新的间隔物，橙色代表间隔物2，红色代表间隔物3，黑色代表质粒骨架。
  2. 向PCR混合物中直接加入1μl限制酶Dpn，以消除pWUR477的残留。
  3. 在37°C孵育1小时。
  4. 使用凝胶电泳根据大小分离DNA产物
  5. 使用Gel和PCR清洁试剂盒根据制造商的说明书净化产品。用20μl洗脱。
  6. 磷酸化纯化的DNA：
    1. 将纯化的DNA在70℃孵育5分钟
    2. 在冰上冷却5分钟。
    3. 加入20μl纯化的DNA：
      3μlT4 DNA连接酶缓冲液 1μlT4多核苷酸激酶 3μlPEG-800（50％） 3μl分子生物学水
    4. 在37°C孵育30分钟。
    注意：也可以用5'-磷酸合成DNA寡核苷酸。在这种情况下，应跳过步骤A2f
  7. 使用Gel和PCR清洁试剂盒，根据制造商的说明书对产品进行纯化。用20μl洗脱。
  8. 自身连接磷酸化的DNA：
    1. 加入10μl磷酸化DNA：
      10μl快速连接缓冲液
      1μl快速连接酶
    2. 在25°C孵育15分钟。
  9. 使用Gel和PCR清洁试剂盒根据制造商的说明书净化产品。洗脱20μl。
重组T7裂解液的制备
1. 将pGeneX和pUC19质粒（缺少同源序列）作为对照转化到NEB5α细胞中。
2. 将每个转化体的一个菌落接种到补充有100μg/ ml氨苄青霉素的3ml LB中，并在37℃下摇动过夜。
3. 将过夜培养物1:100稀释至6ml新鲜的LB中，补充有100μg/ ml氨苄青霉素
4. 在37°C下振荡至600°〜1°。
5. 用WT T7噬菌体以约0.1μg（10μg/天〜10μg/ PFU）的MOI感染5ml培养物。将剩下的1ml培养物作为未感染的对照物。
6. 在37℃下摇动感染的细菌，直到发生裂解（通常为2小时）。
  注意：可以通过“清除”的文化，细胞碎片串或半透明的外观来识别裂解。
选择T7工程噬菌体
1. 将pWUR397，pWUR400和靶向质粒（pAnti-GeneX）或对照质粒（pWUR477）转化到BL21-AI细胞中。
2. 将每个转化体的一个菌落接种到补充有50μg/ ml链霉素，50μg/ ml卡那霉素和35μg/ ml氯霉素的3ml LB中，并在37℃下摇动过夜。
3. 制备补充有50μg/ ml链霉素，50μg/ ml卡那霉素和35μg/ ml氯霉素的至少4个LB琼脂平板（参见食谱）。
4. 将过夜培养物1:100稀释至5ml补充有适当抗生素的新鲜LB中
5. 在37℃（无诱导剂）下振荡直至OD 600〜1。
6. 向培养物中加入0.2％L-阿拉伯糖和0.1mM IPTG（终浓度）
7. 在37°C下摇一个小时。
8. 预热软琼脂（0.7％琼脂，见食谱）到液相。向琼脂中加入0.2％L-阿拉伯糖和0.1mM IPTG，并保持在50℃
9. 预热LB琼脂平板与步骤C3中制备的抗生素在37℃下至少1小时。
10. 对于噬菌体和细菌的每种组合（参见表1），在15ml管中混合：
  100μl细菌（来自步骤C7）在“重组T7裂解液的制备”中制备的10μl噬菌体裂解物 3.5ml预热的软琼脂（0.7％），含有诱导剂
  表1.噬菌体与细菌的组合所有四种不同的组合：用重组/非重组裂解物靶向/非靶向细菌。
11. 短暂地涡旋，立即倒在预热板上。轻轻倾斜并旋转平板以均匀铺展顶部琼脂。
12. 使板冷却5分钟，倒置，并在室温下孵育过夜或在37℃下孵育4-6小时（直到斑块可见）。
隔离和验证
1. 将一个靶向细菌菌落（BL21-AI / pWUR397，pWUR400，pAnti-GeneX）接种到补充有50μg/ ml链霉素，50μg/ ml卡那霉素和35μg/ ml氯霉素的3ml LB中。
2. 在37℃下过夜。
3. 将稀释的斑块大于0.4厘米，加入100微升LB 注意：即使在控制板上也可以使用小斑块。希望的斑块（即具有所需缺失突变的斑块）应该比背景斑块大3-5倍。
4. 对稀释的斑块进行PCR扩增反应以进行验证：使用引物上游和下游的引物。根据PCR产物大小确定基因缺失。使用野生型T7作为阳性对照的模板。见图3.
  注意：删除编码相应原始样本的片段可能导致不编码所需删除（通过转义CRISPR-Cas定位）的孤立噬菌体。
  
  图3. PCR验证的图示。正向和反向引物退火到上游和下游到基因X（绿色）。编辑的噬菌体的PCR扩增产生较小的DNA产物。通过缺失编码相应原始样品的片段的WT噬菌体或噬菌体的PCR扩增产生全长DNA产物。黑色方形代表凝胶电泳，白色条纹代表DNA产品
5. 预热软琼脂（0.7％琼脂）到液相。向琼脂中加入0.2％L-阿拉伯糖和0.1mM IPTG（终浓度），并保持在50℃。
6. 预热LB琼脂平板在37℃至少1小时。每个修改的噬菌体一个板。
7. 在预热的LB琼脂平板上条纹阳性删除噬菌体。
8. 对于每个修饰的噬菌体，混合在15ml管中：
  200μl目标细菌
  3毫升预热的软琼脂与诱导剂
9. 将细菌轻柔倒入条纹板上（步骤D6）。
  注意：将较低浓度区域的细菌倒入软琼脂中，使液体扩散到高浓度端。
10. 使板冷却5分钟，倒置，并在室温下孵育过夜或在37℃下孵育4-6小时（直到斑块可见）。
11. 从每个板上挑一个斑块，重复步骤D3-D9，3次。
12. 在分离的噬菌体上进行PCR扩增，并用DNA测序验证所需的序列
13. 稀释1:50将细菌定向到补充有50μg/ ml链霉素，50μg/ ml卡那霉素和35μg/ ml氯霉素，0.2％L-阿拉伯糖和0.1mM IPTG的5ml LB中。
14. 在37°C振荡至600°至0.5°。
15. 用10μl经过验证的工程化噬菌体感染培养物。
16. 在37℃下摇动感染的细菌，直到发生裂解（通常为2小时）