材料和试剂

移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：2140,2149,2065E，2069和2079E）
75厘米 2具有通气帽的U形斜颈颈细胞培养瓶（Corning，目录号：430641U）
微量离心管，1.5 ml（Sigma-Aldrich，目录号：T6649）
组织培养板，6孔（Corning，Costar ®，目录号：3516）
血清移液管
5 ml（Corning，Costar ®，目录号：4051）
10 ml（Corning，Costar ®，目录号：4488）
25 ml（Corning，Costar ®，目录号：4489）
比武杯
盖子
50ml锥形离心管（Corning，目录号：430828）
人类K562细胞（ATCC，目录号：CCL-243）
催化无活性化脓性链球菌Cas9（SpdCas9）质粒DNA（来自MilliporeSigma;参见图1A）
具有引导序列5'-CCAAGGGTGAGGCCGGGAAG-3'和5'-CATCTCCCCCATGTACACCT-3'的SpCas9 sgRNA质粒构建体用于结合两个人POR 靶位点（来自MilliporeSigma;参见图1B）
空肠弯曲杆菌Cas9（CjCas9）质粒DNA（来自MilliporeSigma;参见图1C）
具有引导序列5'-TTCGCCAGTACGAGCTTGTG-3'的CjCas9 sgRNA质粒构建体用于结合人POR 靶位点（来自MilliporeSigma;参见图1D）

图1.矢量地图
用于在POR 中的CjCas9切割位点处引入诊断性EcoRI位点的单链DNA寡核苷酸供体。寡核苷酸序列是：5'-CACCCTTGGTCTCCCCTTTCCAGCATTCGCCAGTACGAGCGAATTC TTGTGGTCCACACCGACATAGATGCGGCCAAGGTGTACATGG-3'（下划线：生态RI位点）
注意：合成寡核苷酸0.2μmol，通过PAGE纯化。在200μM下将该寡核苷酸重新悬浮于10mM Tris缓冲液（pH 7.6）中
用于扩增靶基因组区域的PCR引物：正向5'-CTCCCCTGCTTCTTGTCGTAT-3'，反向5'-ACAGGTCGTGGACACTCACA-3'
酒精
汉克平衡盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H6648）
Nucleofector仪器（Lonza，目录号：AAB-1001）
Amaxa细胞系Nucleofector Kit V（Lonza，目录号：VCA-1003）
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit（Sigma-Aldrich，目录号：NA2010）
JumpStart Taq ReadyMix（Sigma-Aldrich，目录号：P2893）
GenElute PCR清洁试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：NA1020）
Eco限制酶（New England Biolabs，目录号：R0101S）
10％Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels，15孔，15μl（Bio-Rad Laboratories，目录号：4561036）
Tris缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：T5912）
凝胶加载缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：G2526）
DirectLoad宽范围DNA标记（Sigma-Aldrich，目录号：D7058）
Iscove改良的Dulbecco的培养基（Sigma-Aldrich，目录号：I3390）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
L-谷氨酰胺，200mM（Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
K562培养基（参见食谱）

设备

水浴（Polyscience）
用于无菌组织培养的层流罩，生物安全2级认证（Thermo Fisher Scientific）
微生物培养箱，37℃，大气CO 2（Thermo Fisher Scientific）
移液器（Gilson）
台式离心机（Eppendorf，型号：5417 C）
Mini-PROTEAN四立式电泳池（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658004）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1861096）

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

sgRNA表达的靶位点选择和寡核苷酸设计
1. 核酸酶切割位点选择将依赖于基因编辑目标。对于基因敲除，推荐在前两个编码外显子或蛋白质功能结构域中选择切割位点。对于基因校正或同源重组（HR），切割位点应尽可能接近待改变的核苷酸或靶向整合位点以最大化效率。对于基于胞苷脱氨的编辑，切口位置将依赖于胞苷脱氨窗口。
2. 选择切割位点上游和下游的近端dCas9结合位点。必须将dCas9结合位点与核酸酶结合位点分离约10bp，以避免潜在的位阻，但是超过10bp的分离时，dCas9结合位点也应尽可能保持与核酸酶结合位点尽可能的最大化。 dCas9结合位点可以在DNA的任一条上。
3. 作为基因组编辑工具，CRISPR-Cas效应物核酸酶的优点是可以通过简单的寡核苷酸设计和sgRNA表达质粒克隆进行核酸酶重新靶向，简化了目标位点。在该说明性实验中，两个SpdCas9近端结合位点是：5'-CCAAGGGTGAGGCCGGGAAGGGG-3'和5'-CAAGGTGTACATGGGGGAGA TGG-3'; CjCas9结合位点为：5'-TTCGCCAGTACGAGCTTGTGGGCCACAC-3';其中下划线的核苷酸是原始相邻基序（PAM）。因此，用于sgRNA表达质粒克隆的DNA寡核苷酸序列是：对于SpdCas9结合位点的正向5'ACCG CCAAGGGTGAGGCCGGGAAG-3'和反向5'-AAACCTTCCCGGCCTCACCCTTGG-3' 1;前向5' - ACCG CAAGGTGTACATGGGGGAA-3'和反向5'-AAAC TCTCCCCCATGTACACCTTG-3'用于SpdCas9结合位点2;并向CjCas9结合位点前向5'-ACCG TTCGCCAGTACGAGCTTGTG-3'和反向5'-AAACCACAAGCTCGTACTGGCGAA-3'其中正向序列中下划线的核苷酸是连接到人U6启动子的恒定突出端，并且逆序列中的下划线的核苷酸是用于连接到克隆载体中的SpdCas9 sgRNA支架或CjCas9 sgRNA支架的恒定突出端。 >
转染和基因编辑分析
1. 在Iscove修饰的Dulbecco培养基中培养K562细胞，补充有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺。保持37℃和5％CO 2的培养物。每2-3天分开培养一次，或者当培养物将1/10或1/5的培养物转移到含有预热到37℃的新鲜培养基的新培养瓶中时，培养物达到1-2百万个细胞/ ml 1:10或1：5拆分（见注1）。
2. 在转染前一天将培养物分成25万个细胞/ ml。第二天，文化将达到约50万个细胞/ ml转染（见注1）
3. 准备三个质粒DNA溶液用于在1.5 ml微量离心管中转染（见注2）：
4. 在6孔板的每个孔中加入2ml新鲜培养基，并在37℃和5％CO 2下平衡培养基至少20分钟。转染前。
5. 将Nucleofector程序设置为T-016（见注3）。开启比色皿和一次性移液器，将其放入细胞培养罩内。
6. 用玻璃血细胞计数器计数细胞：
7. 将所需量的细胞转移到无菌的50ml锥形离心管中。每个转染反应将需要100万个细胞（见注4）。将细胞在室温下以200×g离心5分钟。小心地通过抽吸去除培养基。
8. 将细胞沉淀重悬于20ml Hank's平衡盐溶液中。在室温下以200g离心5分钟，并通过抽吸小心地除去洗涤液。将核转染溶液V中的细胞沉淀轻轻重新悬浮至每100μl100万个细胞（见注5）。
9. 将100μl细胞移入含有质粒DNA溶液的1.5 ml管中，充分混匀，轻轻上下移动3-5次。将全部内容转移到核转染细胞比色杯中，并使用T-016程序立即进行转染
10. 使用一次性转移移液管将装有预平衡培养基的移液管添加到比色杯内的转染细胞上，并立即将全部内容物转移到含有预平衡培养基的孔中。核转染后立即在37℃和5％CO 2培养细胞
11. 使用GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit转染后3天提取基因组DNA。使用具有正向引物5'-CTCCCCTGCTTCTTGTCGTAT-3'和反向引物5'-ACAGGTCGTGGACACTCACA-3'的JumpStart Taq ReadyMix扩增POR基因组区域，并且以下循环条件：98℃2 min进行初始变性; 98℃15秒，62℃30秒，72℃45秒的34个循环;最后在72℃延伸5分钟。
12. 用GenElute PCR Clean-Up Kit纯化PCR产物。将消化纯化的PCR产物（每个消化约500ng）与EcoRI（20U）在37℃下反应2小时。使用DirectLoad Wide Range DNA Marker作为标记，从Bio-Rad Laboratories在预制的10％丙烯酰胺凝胶上解决消化产物。图2显示了预期结果的一个例子
  
  图2.使用近端dCas9靶向的CjCas9在K562细胞中的ssDNA寡聚模板化基因编辑。：一种。空肠弯曲杆菌Cas9（CjCas9）和催化无活性的化脓性链球菌Cas9（SpdCas9）人POR基因座中的靶位点和携带诊断生态 RI站点。目标由酒吧指示，PAM以深蓝色（CjCas9）和紫色（SpdCas9）突出显示。 B.DNA寡核苷酸模板化基因编辑的RI消化分析。生态环保RI站点集成效率（％）由ImageJ确定。两个生态 RI限制性片段用黄色箭头表示。 sgRNA编号对应于（A）中的目标数。 ND，未确定。 M，广泛的DNA标记。<br />

数据分析

使用ImageJ测量未剪切带和Eco RI消化条带的带强度。序列整合效率（％）由以下公式确定：100×（b + c）/（a + b + c），其中a是未消化PCR产物的积分强度，b和c分别为限制性消化产物。

笔记

当使用贴壁细胞时，每隔2-3天或当培养物达到约80％汇合时（约80％的表面被细胞占据）分解培养物。在转染前两天分裂培养物。以约20％汇合的方式种植培养物，使得在转染细胞准备时培养物将达到约60-80％的汇合度。
制备浓度≥2μg/μl的质粒DNA，以将每个转染的总体积限制为≤10μl。
不同的细胞系需要不同的核转染程序。使用其他细胞系时，请遵循制造商的说明。
每个核转染可以使用多达200万个K562细胞，但可能会稍微降低转染效率。
不要将细胞留在核转染溶液中长时间（30分钟）。

食谱

K562培养基
500毫升Iscove修改后的Dulbecco的培养基 50ml胎牛血清
5ml 200mM L-谷氨酰胺

致谢

作者希望感谢Patrick Sullivan的R＆amp; D行政支持以及MilliporeSigma的财务支持，MilliporeSigma是德国达姆施塔特的Merck KGaA的业务。该协议最初是作为Chen等人的一部分发表的。（2017）

参考

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