材料和试剂

CyBi-Well Vario 96通道同时移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM ，目录号：5587）的移液器吸头}
V底96孔板（Corning，目录号：3357）
平底96孔板（Corning，目录号：3595）
50ml圆锥管
Corning0.22μm真空过滤系统（Corning，目录号：431098）
T75烧瓶（康宁，Costar）
带有条形码的标签
MCF7细胞（组织培养共享资源，伦巴第癌症中心，乔治城大学）
AllStars Negative Control siRNA（QIAGEN，目录号：1027281）
AllStars Hs细胞死亡siRNA（QIAGEN，目录号：1027299）
AP2A siRNA（QIAGEN，目录号：SI04371283）
GRB14 siRNA（QIAGEN，目录号：SI00430703）
Opti-MEM降低血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31985070）}
IMEM介质（Mediatech，目录号：10-024-CV）
胰蛋白酶-EDTA（0.5％），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15400054）}
炭蒸汽牛血清（CCS）（Gemini Bio-Products，目录号：100-213）
雌二醇（Sigma-Aldrich，目录号：E8875）
细胞滴度蓝（Promega，目录号：G8082）
不含钙，镁，酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS）（GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SH30588.01）}
ER网络siRNA文库（QIAGEN定制）
siRNA缓冲液（QIAGEN）
Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：13778500）}
HiPerfect（QIAGEN，目录号：301704）
Dharmafect 1-4转染试剂（GE Dharmacon，目录号：T-2001，T-2002，T-2003，T-2004）
RNAiFect（QIAGEN）
70％（v / v）乙醇（经Corning0.22μm真空过滤系统过滤）
0.22μm过滤的ddH 2 O - / -

设备

CyBi-Well Vario 96通道同时移液器（CyBio）
Multidrop Combi-nL试剂分配器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5840400）
WellMate微量滴定仪（Thermo Scientific Matrix）
AccuSpin 3R离心机，带Ch.003741转子（Thermo Fisher Scientific，目录号：4393）和带适配器的旋转矩形桶（Thermo Fisher Scientific，目录号：75006449）
磁力搅拌器（Thermo Fisher Scientific）
具有560个Ex / 590 过滤器组（PerkinElmer，目录号：2104-0010）的Envision多标签读板器
500毫升玻璃瓶（康宁，科斯塔）

第一部分转染试剂的选择

程序

在MCF7细胞中转染多种脂质（转染试剂）

对于每个块（12孔），在7个块中的96孔板中转染细胞：
3孔：脂质+ Opti-MEM
3孔：20nM AllStars阴性对照siRNA（QIAGEN，MD）+脂质+ Opti-MEM
3孔：20nM AllStars死亡对照siRNA（QIAGEN，MD）+脂质+ Opti-MEM
3孔：20nM AP2A1 siRNA（QIAGEN，MD）+脂质+ Opti-MEM
对于脂质：在Opti-MEM（Invitrogen，MD）中适当稀释后，将加入稀释的脂质（表1中的配方）（15μl/孔）。稀释的脂质将等分成12孔
表1.稀释脂质的配方为了考虑移液损失，将在Opti-MEM中制备187.5μl（12.5×15μl）稀释的脂质。
对于siRNA：在Opti-MEM（1:3）中稀释1μMsiRNA，并将7μl稀释的siRNA加入每个对应的孔中。每个siRNA分配到21个孔中，因此需要147μl。为了解释移液损失，我们制备了165μl稀释的siRNA：55μl1μMsiRNA + 110μlOpti-MEM。
在100μlIMEM + 5％炭剥离牛牛血清（CCS）+ 1nM雌二醇（Sigma-Aldrich，MI）中分解细胞，计数并计算每孔8000个细胞的稀释度。
设置一个96孔板：

吸管siRNA（用于脂质对照孔的Opti-MEM：A1-12，E1-9），7μl/孔至以下孔：siNEG，孔B1-12和F1-9; siAP2A1，孔C1-12和G1-9; siDEATH，井D1-12和H1-9。
移液脂质混合物（中等对照孔的Opti-MEM：E10-12，F10-12，G10-12和H10-12），15μl/孔至以下孔：A1-12，B1-12，C1-12，D1 -12，E1-9，F1-9，G1-9和H1-9（参见图1的板布局）。

图1.转染试剂选择板的布局。在MCF7细胞中测试各种转染试剂的效率。
在室温下孵育20分钟，然后用WellMate微孔板分配器（Thermo Scientific Matrix，USA）加入100μlMCF7细胞/孔，然后在37℃，5％CO 2温度下孵育。
五天后，向每个孔中加入20μl1：1 Cell Titer Blue：HBSS混合物，37℃孵育，使细胞将resazurin转化为resorufin。荧光信号由Envision多标签阅读器（激发波长560nm /发射波长590nm）每小时至4小时测量。对于该实验，2小时通常是4小时读出的最佳时间点，接近测定动态范围不受影响的最大信号。

数据分析

使所有细胞生长归一化以控制细胞（在孔E，F，G和H10-11中）。接下来，评估由阴性对照siRNA（siNEG，孔B和F），死亡对照siRNA（siDEATH，在孔D和H中）和AP2A1 siRNA（在孔C和G中）诱导的生长抑制。然后，比较各种转染试剂的效果。 AP2A1 siRNA的活力应在siNEG和siDEATH之间的动态范围的中间。选择含有转染试剂的脂质混合物，其不仅具有最高的生存力与siNEG，而且也是siDEATH的最低存活力。

第二部分Z'分数确定

程序

第1天
在含有0.24μMsiNEG和siDEATH（使用图2所示的布局）的V底96孔板中设置siRNA Z'刻板。制备0.24μMsiRNA溶液：72μl20μMsiRNA在5,928μlsiRNA悬浮液中混合;或1,440μl1μMsiRNA在4,560μlsiRNA悬浮液中混合。将100μl稀释的siNEG或siDEATH（0.24μM）分配到每个孔中（使用图2所示的布局）。然后将siRNA Z'评分板在-20℃冷冻以备后用。

图2. siRNA Z'评分板的布局

第2天
每个实验板（96孔板，Costar，Corning，USA）必须具有10.5μl稀释的脂质转染试剂，10μlsiRNA和每孔8,000个细胞。两个重复板在一个实验中运行。对于两个板（192个孔），需要2,016μl转染试剂。由于缺少机器启动，将3ml总转染试剂加载到Combi-nL机上，每台样品在两个实验板中分别加入到每个孔中。在室温下解冻后，从CySIO机上的每个孔中，将每个含有10.5μl稀释的转染试剂的每个实验重复平板移取10μl的siRNA Z'评分板。细胞中siRNA的最终浓度为20nM。接下来，细胞将被添加到实验板中以供Wellmate微孔板分配器培养。

过程和时间线

用15ml 70％乙醇（0.22μm真空过滤器预过滤），然后加入15ml ddH 2 O（0.22μm真空过滤器预过滤），最后15次ml IMEM（无血清）
分裂细胞和计数。在一个孔中稀释8,000个细胞（100μl）（对于一个96孔板，80,000个细胞/ ml，需要16ml，在50ml锥形管中制备40ml）。如果需要，新瓶中的细胞细胞。
在50ml锥形管中分配15 ml Opti-MEM。
用7ml过滤的（0.22μm）70％乙醇，7ml蒸馏水（0.22μm过滤），7ml Opti-MEM清洁组合物。
将siRNA Z'刻板从-20℃取出并在室温下解冻。接下来，将离心机中的旋转板在3,500rpm（1,935×g / g）的孔中心获得液体，室温5分钟，立即取出以保持冷凝形成。
稀释转染试剂：将144μl在2.86ml Opti-MEM中的50ml锥形管中
通过Combi-nL机将10.5μl/孔稀释的转染试剂分配到每个Costar 96孔板（实验板）上。
启动Cybio机器，装载板和运行程序（图3）将siRNA从siRNA Z'评分板分发到实验板（预加载步骤2g的脂质）。板材的装载位置：
1. 在CyBio上的堆叠A（左臂）上的siRNA Z'评分板。
2. 实验板装载在堆叠A（右臂，稀释脂质）CyBio上。
在室温下等待10分钟，以在实验板中形成siRNA-脂质复合物。等待时，在WellMate分配器上设置分配程序。
使用WellMate微孔板分配器将100μl细胞/孔分配到每个实验板中，在37℃，5％CO 2/2下孵育实验板。
用15 ml过滤的ddH 2 O，然后15 ml过滤70％乙醇清洗WellMate分配器，关闭机器。
用7毫升蒸馏水和7毫升过滤的（0.45微米）70％乙醇清洗Combi-nL分配器，关闭机器。

图3. Cybio程序将siRNA分配到实验板中。 A.程序的第一部分; B.程序的第二部分。

第7天
向每个孔中加入20μlCell Titer Blue：HBSS的1：1混合物，每小时读出4小时（如上所述）。

数据分析

基于Cell-Titer Blue读出，计算siNEG和siDEATH的平均生存值。计算Z'评分：Z'-score = 1 - （siDEATH的3×SD + 3×SD的siNEG）/（siNEG的平均生存力读数 - siDEATH的平均生存力读数）（Zhang等， em>，1999; Birmingham等人，2009）。 Z'-score的合理范围在0.7-1之间。如果Z'评分小于0.7，则重新评估测定参数并重复Z'评分实验。一旦Z'评分在范围内，继续进行大规模的RNAi文库筛选。
这里显示了一个Z'评分测试的代表性生存力测量（图4A）和点图（图4B）。在该实验中，从图4A获得siNEG，siDEATH和相应的标准偏差值（S.D.）的平均生存力读数。然后，Z'评分计算为0.81，在0.7-1的范围内，因此本实验中使用的测定参数对于siRNA文库筛选是最佳的。

图4. Z'评分测试的代表性数据。：一种。 Cell Titre蓝色阅读的生存力测量。紫色井：siDEATH转染细胞;白井：siNEG转染的细胞。 B.生存力测量的点图。每个点表示每个孔中细胞轮胎蓝色读数的值。点上方表示含有siNEG转染细胞的孔;较低的点线表示这些具有siDEATH转染细胞的孔。

第三部分。筛选RNAi库

程序

用于RNAi筛选的SiRNA制备
1. 在本文中，我们以ER网络RNAi文库筛选为例来描述方案。 ER网络siRNA文库含有针对631个基因的siRNA，其由QIAGEN（MD，USA）定制。将针对这些基因的siRNA分布到11×96孔板中。为每个基因选择两个siRNA并在一个孔中混合。
  注意：对于其他siRNA文库筛选，将基于目标基因的数目和每个基因的靶向siRNA数量来确定平板的总数。总之，RNAi文库中含有siRNA的孔的总数和最终布局将修改筛选方案。
2. 计算制备11个平板（每孔100μl）所需的各种对照siRNA（0.24μM）的量：
使用RNAiMAX转染试剂在MCF7细胞中的雌激素受体siRNA文库筛选
第1天
高压灭菌500毫升玻璃瓶和磁力搅拌棒。

第2天

设置siRNA库平板（库存浓度：0.24μM，在V底96孔板中）。布局图显示在以下96孔板（图5中的板＃1-10，图6的板＃11）中。 siRNA文库平板的总数为11.未标记的孔用于针对ER网络靶基因的siRNA。标记的孔用于各种对照（NEG，DEATH，AP2A1和GRB14和MOCK [siRNA悬浮液缓冲液]）。将100μl稀释的siRNA分配到每个孔中，储备在-20℃。

图5. ER网络siRNA文库板＃1-10的布局

图6. ER网络siRNA文库板＃11的布局
接下来，准备11个平底96孔板作为实验板。这些11个板的条形码需要打印并粘贴在板（前面和中部）上。标记后，将这些板储存在细胞培养罩中过夜。同时，确认所有材料，包括筛选培养基，转染试剂，平板，移液器吸头和细胞培养物都已准备就绪。
Cybio程序（图7）将从V底板的0.24μMsiRNA ER文库中吸取10μl，然后混合到已经具有10.5μl稀释的RNAimax转染试剂的Costar 96孔板中。细胞中siRNA的终浓度为20nM

图7. Cybio程序将siRNA分配到RNAi筛选实验板。 A.程序的第一部分; B.程序的第二部分。
每个实验板（Costar 96孔板）必须使用Combi-nL分配机将每孔加入10.5μl稀释的脂质转染试剂（0.5μlRNAimax +10μlOpti-MEM培养基）。 96孔×10.5μl=1,008μl，11个板11,088μl。计算机启动的损失，为11块板15毫升。然后将这些siRNA和实验板载入Cybio机器如下：
1. 装载在左臂，堆叠A上的siRNA ER库平板（0.24μM，11个板），在装载前从底部升起盖子，盖子被移除;
2. 实验板（11板）装载在右臂，堆叠A;板材从底部上升，盖子在装载前取下。
过程和时间轴
1. 在室温下解冻siRNA文库平板（库存浓度：0.24μM）
2. 清洁WellMate微孔板分配机，装有15ml过滤的70％乙醇，然后加入15ml过滤的ddH 2 O和15ml IMEM培养基（不含血清）。
3. 分解MCF7细胞并计数。以100μl（80,000个细胞/ ml）稀释8,000个细胞。对于一个板：需要16ml稀释的细胞。因此，对于11板：将250ml稀释的细胞在500ml无菌瓶中，用磁力搅拌棒上的磁力搅拌器，速度低。如果需要，新瓶中的细胞细胞。
4. 使用7 ml过滤的70％乙醇，7 ml过滤的ddH 2 O和7 ml Opti-MEM培养基清洗Combi-nL分配机。
5. 当siRNA文库板解冻时，在室温下以3500rpm（1,935×g）离心5分钟。立即取出，以防止形成冷凝。
6. 在50ml锥形管中分配15 ml Opti-MEM。
7. 稀释转染试剂：在50ml圆锥管中的14.3ml Opti-MEM中的720μlRNAimax。
8. 将10.5μl/孔稀释的转染试剂分配至11个实验板（Costar 96孔板）
9. 在Cybio机的指定堆上装载实验板和siRNA板。 siRNA板：左臂，堆叠A;实验板：右臂，堆叠A.装载前取下盖子，板从底部上升。
10. 启动Cybio机器，运行程序（图7），如附件板布局（图5和图6）所示，分发11个文库siRNA片段。设置一个定时器，记录每个正在处理的板的时间。完成此步骤时，继续下一步。
  注意：在这个例子中，运行一个盘子和更换提示的时间是1分15秒。总机运行过程大约需要15分钟。
11. 在完成含有稀释的siRNA-脂质混合物的前四个实验板之后，将这些板转移到细胞培养罩。第二个人应该继续在Cybio机器上运行余下的盘子。
12. 在等待从siRNA-脂质混合物的时间开始10-15分钟后，使用WellMate微孔板分配器将100μl细胞/孔分配到前四个实验板。再等5分钟，然后用5〜7ml细胞悬浮液灌注WellMate机器，分配4个平板的细胞;然后等待5分钟，主机用5-7毫升细胞悬浮液，分配最后3块板的细胞。记录每个板块接收的细胞。
  注意：
  2. 将WellMate分配器探针放入稀释的细胞中，只有在将细胞添加到实验板之前不再更早，然后将每个组的5-7 ml细胞悬液加入机器。
13. 用15ml过滤的ddH 2 O，然后15ml过滤的70％乙醇清洗WellMate分配器，并关闭机器。
14. 用7毫升蒸馏水和7毫升过滤的（0.45微米）70％乙醇清洗Combi-nL分配器，关闭机器。
  
  第7天
  向每个孔中加入20μlCell Titer Blue：HBSS的1：1混合物，每小时读出4小时（如上所述）。

数据分析

从相应孔的数据（模板1-10：A5，A11，C1，F12，H2和H8;板11，A5，A-G11）计算每个对照的中位数生存力值（细胞滴度蓝色读数，任意单位），C1，F12，H2，H8和G10）; siNEG（所有板：A1，A3，A7，A9，A12，E1，E9，D9，D12，H1，H4，H6，H10和H12）; siDEATH（所有板：B1，B12，A6，E12，G1和H7）; siAP2A1（所有板：A2，A8，D1，G12，H5和H9）; siGRB14（所有板：A4，A10，C12，F1，H3和H11）。确定AP2A1或GRB14 siRNA是否产生细胞中值杀死，如果死亡对照siRNA杀死超过90％的细胞。如果是这样，请继续进行以下数据处理和分析。如果没有，请回头用技巧拍摄麻烦。
计算每个siRNA转染细胞的活力指数（VI），归一化为阴性对照siRNA转染细胞的中值：

VI =（siRNA转染细胞的存活力）/阴性对照转染细胞的中位生存力
需要进行三次独立的实验，获得每个基因敲除细胞的平均VI。可以利用VI的任意阈值小于0.5。这些基因组的敲除诱导了50％的生存力或更多的损失被鉴定为感兴趣的基因，这被认为是反映强大的生物学效应，然后继续进行额外的验证。
siRNA验证
通过损失更多的以下siRNA敲低（VI≤0.5）的50％存活率确定的命中进行了验证研究。对于每个确定的命中，在单个孔中测试靶向相同基因的四种不同的siRNA（QIAGEN，MD）。四种siRNA中的两种与可用的筛选中的siRNA相同。其他两种siRNA是新的测序序列。如上所述筛选细胞。如果测试的四个siRNA中至少有两个测试将可行性降低了至少50％，则候选人通过验证作为推定的命中。

笔记

我们一次筛选了一个44个实验板用于一个RNAi筛选实验。在一个实验中处理多个板时，请记住脂质siRNA复合物形成时间应限制在10-15分钟，记录脂质添加时间（CyBio），并在（WellMate）后10-15分钟计算细胞分配时间饮水机）。更短或更长的等待时间可能导致转染效率和基线细胞存活率的变异性，可以使用每个平板上包含的相关对照进行检测。
就VI设定阈值和验证的阈值而言，我们在研究中选择了0.5（VI）。这些基因导致基因敲除后50％存活力或更多的损失被鉴定为命中。选择适当阈值的标准是阈值必须反映出强大的生物效应。该值可根据项目进行调整。
时间录制
筛选检查单

致谢

这个协议是从以前的Zhang等人的作品（2016）中改编而成。感谢Wei Xu，Alan Zwart，David Goldstein和Annie Zoo的技术援助。作者受到R01CA050633，CA51880，U54 CA149147（LMW），R01CA63366和R21CA181287（至EAG）的支持。

参考

Astasaturov，I.，Ratushny，V.，Sukhanova，A.，Einarson，MB，Bagnyukova，T.，Zhou，Y.，Devarajan，K.，Silverman，JS，Tikhmyanova，N.，Skobeleva，N.，Pecherskaya， A.，Nasto，RE，Sharma，C.，Jablonski，SA，Serebriiskii，IG，Weiner，LM和Golemis，EA（2010）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： .ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 20858866”target =“_ blank”>以EGFR为中心的网络的合成致死屏幕，以改善靶向治疗。 Sci Signal 3（140）：ra67。
Birmingham，A.，Selfors，LM，Forster，T.，Wrobel，D.，Kennedy，CJ，Shanks，E.，Santoyo-Lopez，J.，Dunican，DJ，Long，A.，Kelleher，D.，Smith ，Q.，Beijersbergen，RL，Ghazal，P.and Shamu，CE（2009）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 19644458”target =“_ blank”>用于分析高通量RNA干扰屏幕的统计方法。 Nat方法6（8）：569-575。
Boutros，M.，Ahringer，J.（2008）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18521077”target =“_ blank”遗传筛选的艺术和设计：RNA干扰。 Nat Rev Genet 9（7）：554-566。
Murray，JC，Aldeghaither，D.，Wang，S.，Nasto，RE，Jablonski，SA，Tang，Y.，Weiner，LM（2014）。＆nbsp; c-Abl调节肿瘤细胞对抗体依赖性细胞毒性的敏感性。 2（12）：1186-1198。

Zhang，JH，Chung，TD and Oldenburg，KR（1999）。＆nbsp; 用于评估和验证高通量筛选测定的简单统计参数。生物学屏幕 4（2）：67-73。

Zhang，YW，Nasto，RE，Varghese，R.，Jablonski，SA，Serebriiskii，IG，Surana，R.，Calvert，VS，Bebu，I.，Murray，J.，Jin，L.，Johnson， Riggins，R.，Ressom，H.，Petricoin，E.，Clarke，R.，Golemis，EA and Weiner，LM（2016）。＆nbsp; 获得雌激素独立性诱导支持乳腺癌细胞增殖的TOB1相关机制。致癌基因 35（13）：1643-1656。