移液器（例如Eppendorf，型号：Research ® plus）
125ml锥形瓶（高压灭菌）
橡胶灯泡
10毫升玻璃移液器（高压灭菌，堵塞）
离心机
孵化器为C.线虫（Lovibond Thermostatic Cabinet）
立体显微镜（Nikon Instruments，型号：SMZ745，眼线：C-W10xB / 22，放大倍率2.5x至50x）
杂交烤箱（Hybaid Shake'n'Stack）
37℃培养箱（Heraeus Instruments）
SpeedVac（Labconco冷冻干燥系统连接到Savant SpeedVac集中器或Savant Instruments，型号：SC11OA SpeedVac ® Plus）
HPLC系统

默克日立FL检测仪L-7485（日立，型号：L-7485型）
接口D-7000（日立，型号：D-7000）
自动进样器L-7200（日立，型号：L-7200）
泵L-7100（日立，型号：L-7100型）
立柱烤箱L-7350（日立，型号：L-7350）
试剂泵：Shimadzu LC-10AD（Shimadzu，型号：LC-10AD）;柱：Phenomenex Luna 5u C18（2）100A（Shimadzu）

软件

D-7000 HPLC系统管理器（HSM）软件版本4.1
GraphPad Prism版本5.0b for Mac OS X（GraphPad Software，San Diego California USA， www.graphpad.com

程序

完整的流程图如图1所示

图1.线虫生长和GAG纯化的流程图

注意：除非另有说明，所有的工作都是在室温下在非无菌条件下在实验台上进行的。在乙醇燃烧器附近进行线虫板的处理，并且通过与乙醇火焰接触将所有移液管，移液管吸头和瓶迅速加热灭菌。所有介质和缓冲液组合物都在“配方”下进行描述，在文中未提及

C的增长。线虫用于GAG分析
为了获得大量的用于GAG分析的材料，蠕虫在富含线虫生长培养基（RNGM）板（参见食谱）（10-20平板，直径10cm）上种植。大肠杆菌HB101。电子。 co li HB101被选中，因为它们易于蠕虫消化，并允许从板上恢复许多蠕虫：

从新鲜LB平板上的甘油储备液中分离出HB101细菌（参见食谱）。在37°C将细菌生长过夜。

接种50毫升2x YT培养基（见食谱）与一个细菌菌落。在37℃下，在125ml三角烧瓶中以200rpm摇动过夜（应用16小时）。

准备10厘米RNGM板。让他们一夜之间干

第二天：HB101的连续层的种子板（应用600μl的细菌培养物，在图2中以黑色概述）。将板子在板凳上干燥过夜，直到需要在4℃下储存在含有薄纸的密封容器中。

图2.连续细菌层的概况

将线虫的混合阶段转移到RNGM板（每个菌株用于RPIP-HPLC的10个板，用于LC-MS / MS的20个板或需要多个下游处理步骤的实验），通过切割块℃。 elegans 维护板（根据这里描述的程序准备： http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e164 ），这些面朝下放在RNGM板上。

生长动物直到盘子含有许多蠕虫，但确保它们还没有饿死（ ie ，确认平板仍然有大量的细菌食物，他们没有很多的狗，被发现逮捕通常在恶劣的生长条件下看到的动物，如饥饿，热应激和高人口密度，等）。取决于通常需要三至七天的转移动物的菌株和数量。

用相同菌株（10-20个平板，取决于实验）接种的单独的板块成为5个堆。通过将10ml M9缓冲液（参见食谱）移至第一个板上（使用橡胶球和10 ml高压灭菌的玻璃移液管）收集蠕虫。用相同的溶液冲洗板三次，并在第二次冲洗后用移液管小心地刮去琼脂表面，机械地分开蠕虫。将相同的10ml移液到第二块板上，重复，直到五块板都用相同的缓冲溶液洗涤。用10ml新鲜的M9缓冲液重复此过程，此时从第五块板开始，然后第四次，直到所有的五个板都洗两次。

将所有洗涤组分（15或50 ml管，取决于样品体积）进行收集，并以500 x g离心4分钟收集蠕虫。

去除上清液（移液管和橡胶球），并将蠕虫颗粒分散在5-10 ml M9缓冲液中（取决于缓冲液中的细菌密度和样品体积）。重复离心和洗涤，直至没有细菌痕迹（通常需要2-3个洗涤步骤）。

从蠕虫颗粒中除去M9缓冲液，并用5-10ml ddH 2 O洗涤，以减少盐的剩余量。如上所述重复离心，并将沉淀的蠕虫（通常在100和500μl之间）转移到1.5 ml螺丝锁管。
注意：切掉用于转移蠕虫颗粒的1毫升吸头的尖端。

如上所述离心，去除尽可能多的上清液。在SpeedVac中旋转管，应用真空（确保在几分钟内建立真空），并将样品干燥过夜。
注意：如果需要确定干重，应在添加蠕虫之前确定空管的重量。含有干燥蠕虫和空管的管的重量差异代表蠕虫培养物的干重。

注意：

HB101培养物可以在4℃下储存长达两周。

种子RNGM板通常在需要时制备，不应该储存超过两周。

当许多RNGM平板并口接种时，重要的是选择含有大约相同数量蠕虫的琼脂块，以便所有的板都将同时充满蠕虫。

当使用M9洗涤RNGM板材时，重新进行第二次洗涤的板材的顺序，以确保所有的板材都用足够干净的M9缓冲液洗涤，同时也洗去细菌。

如果两次洗涤后，如果许多蠕虫仍然存在于板上，则使用另外的10ml M9从最多10个RNGM平板上收集相同基因型/治疗的残留动物。

干燥的线虫样品可以在-20℃下储存数月，不影响GAG分离。

用于GAG分析的线虫鸡蛋的分离
当在C上进行GAG分析时。线虫胚胎阶段，蠕虫生长为混合阶段（ ie ，不同步，因此包含胚胎，幼虫和成年阶段，见
http://wormatlas.org/hermaphrodite/introduction/Introframeset.html ）上述RNGM板，并收集在M9缓冲液中。
注意：强烈推荐第A部分注释e所述的第三次洗涤步骤，因为鸡蛋往往会粘在板上。
1. 颗粒蠕虫通过在4℃下以2,000×g离心4分钟并用移液管除去上清液。
2. 使用3.5ml ddH 2 O，1ml NaClO和0.5ml 5N KOH孵育蠕虫小球，直到除蠕虫卵溶解（约8分钟）为止。
  注意：将管子保持在手中以增加温度，并持续旋转甚至搅拌均匀。通过在立体显微镜下定期检查管子来检查溶解进程，以避免过度漂白和杀死鸡蛋。
3. 通过在1,300xg下在4℃下离心2分钟来制备颗粒虫卵。去除上清液并用5ml ddH 2 O洗涤卵，然后在4℃下以2,000×g离心1分钟。重复洗涤步骤两次。
  注意：这些条件可能太苛刻，无法从卵中恢复幼虫，因为它们被优化用于收集即将到来的同质化鸡蛋。
4. 将蛋转移到螺丝锁管，如上所述离心机，如步骤A11所述在真空下干燥。

样品溶解
使用阴离子交换层析的样品裂解和纯化GAG由前述方法（Ledin等人，2004; Dagalv等人，2011）改编。如果样品已被冷冻，则在室温下短暂融化（最多15分钟）。

加入所需最终体积的80％（1ml蛋白酶缓冲液[参见食谱]每30mg干物质），并在96-100℃下煮沸样品10分钟，然后短暂离心以收集底部的所有液体管子。
通过直径减小的针连续通过样品（参见材料和方法）。根据样品量使用1或2 ml注射器。对于蠕虫的混合阶段，用18G针头开始裂解（10次通过上下，仔细避免任何过度或针头堵塞），然后用23G针头（与18G相同的程序）开始裂解。对于蠕虫卵，从23 G针开始就足够了。如果可能，也可以通过27 G针进行样品。
注意：27 G针很容易堵塞，所以非常小心使用！尽可能使用相同的注射器进行所有步骤和空针，以避免材料损失。
称取蛋白酶XIV粉末，溶解在蛋白酶缓冲液中，得到最终浓度为0.8mg / ml。例如，如果最终体积为1ml，则将0.8mg蛋白酶XIV溶解于0.2ml蛋白酶缓冲液中并加入0.8ml均质样品中。
在杂交烘箱中，将样品在55℃孵育约24小时，恒定旋转。
注意：螺旋锁管在此步骤中至关重要，因为常规反应管可能不会保持紧固。
在96-100℃温育10分钟，使蛋白酶热灭活。以最大速度离心样品10分钟（16,060 x g）。
如果确定DNA浓度，为了此目的，保留每个样品4μl 注意：可以立即执行或在-20°C储存后进行。
加入1M MgCl 2，终浓度为2mM MgCl 2，并加入38U（一个单元在30分钟内消化37μgDNA）每ml裂解物的Benzonase。在37℃下孵育样品过夜（通常为16-18小时）。
注意：如果并行处理许多样品，则可以使用1 M MgCl _{2 和Benzonase的主混合物。}
停用苯甲酸酶，然后如上所述用于蛋白酶失活进行离心。

注意：蛋白酶XIV粉末和Benzonase溶液储存在-20°C

离子交换色谱用于CS纯化
非硫酸软骨素（Chn）在C中是非常丰富的。线虫，并且可能掩盖了硫酸化GAG的分离。以下提出的方案已经优化用于分离硫酸化GAG HS和CS（Dierker等人，2016）。关于孵育时间和温度的细节可以在图3中找到，并且在不同步骤期间使用的缓冲液的盐浓度如图4所示。

图3.离子交换色谱的孵育时间和孵育温度

图4.高亲和力和低亲和力GAG馏分中的NaCl浓度

将足够的DEAE-Sephacel浆液转移到10ml Poly-Prep（色谱柱）色谱柱中，床体积为600μl（Ledin等人，2004）（参见图5）。
注意：泥浆可以用刮刀，移液或将其倒入色谱柱中进行转印。为了保持树脂处于最佳状态以进行长期储存，建议将浆料混合均匀，并在移液前将塑料移液器吸头切断。

图5. DEAE列的最终床体积
在装载样品之前，分别用2ml（> 3柱体积）1.5M NaCl，ddH 2 O和DEAE洗涤缓冲液pH8洗涤柱子（参见食谱）。
注意：可以预先准备色谱柱，然后在使用前再进行水化。
使用5 M NaCl将裂解液中NaCl的最终浓度调至0.25 M
将裂解物加载到预洗柱（注意：避免任何沉淀，因为如果样品已被冷冻，则可能会堵塞步骤C5中描述的柱重复离心！）。用提供的盖（顶部）和锁（底部）密封柱，如图6所示。在4°C的轨道摇床上孵育1小时（参见图2和图7）。

图6.加载样品的密封DEAE列

图7.在摇摆桌上孵育的密封柱
取出帽子和锁，并收集15ml反应管中的流分。用ddH 2 O稀释流过馏分，使其最终浓度为0.1M NaCl，然后将其装载到第二柱（与第一柱并行制备）。如步骤D4所述孵育1小时。
注意：绑定到第一列的GAG被指定为“高亲和力”分数，并且与第二列结合的GAG被定义为“低亲和力”分数。
取出盖子和锁，并允许样品通过色谱柱。
用4ml DEAE洗涤缓冲液pH8洗涤所有柱，如前所述进行密封，并在室温下在摇床上孵育柱10-15分钟。
取出盖子和锁，并使洗涤缓冲液通过柱（参见图8），然后用4ml DEAE洗涤缓冲液pH 4洗涤（参见食谱）。密封如前所述，并在室温下在摇摆板上孵育10-15分钟。

图8.允许洗涤缓冲区通过列
取出盖子和锁，并使洗涤缓冲液通过柱子，然后用3ml 0.1M NaCl（低亲和力）或0.25M NaCl（高亲和力）洗涤。如前所述密封，并在室温下在摇摆板上孵育15-30分钟。
去除盖子和锁，并允许洗涤缓冲液通过柱子。使DEAE树脂完全排出，每列加入5.4 ml 1.5 M NaCl。在室温下密封并在摇摆板上孵育1小时，以有效地洗脱GAG。
在10ml圆底管中收集洗脱液。通过SpeedVac离心将洗脱液的体积减少到约1.7ml。

注意：

确保在应用新缓冲区之前，列底部已被密封
可以使用石蜡膜来密封色谱柱，但所提供的锁非常紧凑，易于处理。
重载DEAE列可以减少恢复。我们根据DEAE对高度硫酸化肝素的结合能力计算所需的床体积，以避免过载。但是，这些计算可能需要适用于其他样本。

脱盐样品
使用NAP-10柱进行脱盐：

根据制造商的说明，清洗具有至少六列体积ddH 2 O的色谱柱。
确定浓缩洗脱液的体积并加载。
注意：不能超过0.9毫升的样品一次可以脱盐，所以如果体积超过这一点，装载一半的洗脱液。
在样品进入色谱柱后添加ddH <2> O（步骤E2和E3的总体积应为1ml）。
将1.0-1.3ml ddH 2 O（1.4ml减去步骤E3中使用的体积）的Elute GAG放入10ml圆底管中。
洗涤具有至少七个柱体积的ddH 2 O的柱，以便制备它们用于下一个洗脱液并重复脱盐程序。
在SpeedVac离心机中完全干燥样品。

注意：

NAP-10色谱柱可以重复使用。用至少七列体积的ddH 将色谱柱洗涤，并在室温下将其储存在20％EtOH中。 />
为了避免样品之间的污染，也可以用1ml 5M NaCl洗涤柱，然后用ddH 2 /以除去任何剩余的高分子量污染物。
干燥的GAG通常具有“蓬松”的白色外观，而残留的盐是白色的，并且是结晶的。将疑似含有盐的样品溶解在100μlddH 2 中，并将1μl样品与0.1％AgNO / EM> <子> 3 。如果溶液中出现白云（类似于或强于含有1μl0.1 M NaCl的平行管），则将样品溶解在500μlddH 2 并重复脱盐。对所有并行样本执行此步骤，以确保以相同的方式对其进行处理。

GAG降解和HS纯化
我们使用的肝素酶也显示出弱CS降解活性，这就是为什么在HS消化和分析之前彻底去除CS是重要的：

在ddH 2 O中重构脱盐样品。
每管加入20μl5x软骨蛋白酶缓冲液（最终体积：100μl）（参见食谱）。
每mg干燥起始原料添加约1 mU软骨素酶（CSase）ABC。
在37℃孵育过夜（最少16小时）。
在96-100℃下热灭活CSase ABC 10分钟，并以最大速度离心样品10分钟。
如果不进行HS分析，将完整的样品转移到HPLC管中，并用ddH 2 O调节体积至100μl，以补偿孵育时间中的任何损失。进行“数据分析”中所述的二糖分析。
如果另外关于HS组成的信息将被确定，可以将5-20％的样品保存在用于CS组成分析的HPLC管中。
用ddH 2 O和5 M NaCl将剩余样品的体积调节至500μl，达到0.1 M NaCl的终浓度。
根据程序D所述准备DEAE柱（200μl床体积）
加载样品，密封柱，并在4℃下摇摆孵育1小时。
用1.2ml DEAE洗涤缓冲液pH8，1.2ml DEAE洗涤缓冲液pH4和1ml 0.1M NaCl洗涤柱子，无需进一步培养。
将洗涤缓冲液从柱中排出，并在室温下摇摆，将柱与1.8ml 1.5M NaCl孵育1小时，洗脱HS。
在2ml反应管中收集洗脱液，并将它们在SpeedVac离心机中浓缩至600-800μl
按照程序E所述，在NAP-10柱上脱盐。
注意：样品中HS的含量远低于CS，因此干燥后几乎不会有沉淀。
将脱盐的样品重新置于100μlddH 2 O中，将其分成2x 50μl等分试样，并向其中加入49μl2x HS消化缓冲液。
加入1μl肝素酶混合物（每个肝素酶I，肝素钠酶II和肝素酶III为0.4mU）至一个等分试样和1μl1x HS消化缓冲液（参见Recipes）至另一份。
注意：未消化的样品在HPLC运行中用作背景控制，参见“数据分析”）。
在37℃下孵育所有样品过夜（超过16小时）。
如步骤F5和F6所述，热灭活，离心并将样品转移到HPLC管中
注意：

HS和CS消化缓冲液可以等分并储存在-20°C以延长保质期。
其他缓冲液在室温下储存。
CSase ABC（-20℃）和肝素裂解酶（-80℃）以5-20μl的等分试样储存，并避免多次冷冻。

数据分析

反相离子配对HPLC
二染色体分离的条件（由CSase ABC消化产生或通过用肝素裂解酶I，II和III的混合物切割产生）和用2-氰基乙酰胺进行后柱衍生化的条件由Ledin等人（ 2004），并由Dagalv等人（2011）轻微修改。
1. 使用D-7000 HPLC系统管理器（HSM）软件4.1版，使用相同样品系列分析的二糖标准物，根据其洗脱位置和峰值大小来鉴定和定量峰。
  注意：准备不同类型的HS和CS二糖作为储备溶液的相似浓度（μg/μl），并混合以产生HS和CS标准品。为D-7000 HSM软件添加倍增因子，以解释二糖的不同分子质量。
2. 在我们手中，HS样本中的背景噪声（CS样本中不存在）需要将非酶处理样品用作背景对照;从酶处理样品的色谱图中减去这一点。
3. 将经过处理和未处理的样品直接相互连接起来，以最小化运行之间缓冲区条件的变化。
4. D-7000 HSM软件将数据导出到Excel文件中。我们建议使用“宏”（Excel的编程指令集）根据相关标准的信号计算每峰值的总pmol。色谱图以及计算结果如图9所示
  
  图9.由D-7000 HSM软件导出的色谱图（上图）和计算（下图）
5. 使用总pmol值计算每个样品中某种二糖（二糖组成）的相对量。
6. 总硫酸化根据硫酸二糖的相对量计算，因此以每100个二糖的硫酸化度计算。
7. 为了量化给定样品的总回收率，在校正注射样品的比例后，回收的GAG的量（以pmol计）可以归一化为mg干重。
  注意：一般来说，注射10-90μl以确保色谱柱不会过载。
8. 作为干重的替代方案，样品也可以在Benzonase处理前对DNA含量进行归一化（参见方法C，步骤C7）。我们根据制造商的说明使用Quant-iT TM 宽范围测定试剂盒（从Molecular Probes购买），并对使用此方法的结果感到满意。
9. 当比较野生型和突变株时，我们使用纯化和平行分析的样品。我们认为在不同日子生长和分离的样品是独立实验，通常进行至少三次独立实验
统计分析和数据呈现
1. 所有图形都是使用GraphPad Prism版本5.0b为Mac OS X生成的（GraphPad Software，San Diego California USA， www.graphpad .com ）。
2. 图表显示平均值和误差条定义平均值（SEM）的标准误差。
3. 在可能的情况下执行单尾Mann-Whitney测试，并且
  0.05被认为是重要的

笔记

生长条件将影响GAG组成，最有可能是由于C期间GAG结构的变化。线虫开发。因此，我们建议只比较在类似条件下生长的蠕虫。比较同一发育阶段的动物，大大提高了我们手中的再现性。
即使NAP-10色谱柱可以重复使用，也不应该保留高分子量分子，我们建议仅对相似的样品重复使用色谱柱，而不是为了避免污染物质。
当分析来自线虫的GAGs的链长时，我们注意到它们似乎比哺乳动物的短。因此，此处提出的方案可能需要优化从其他物种中分离硫酸化和非硫酸化GAG

食谱

注意：除非另有说明，否则缓冲液用非高压灭菌的去离子水制备并在室温下储存。灭菌的缓冲液经高压灭菌（120℃，20分钟）或通过0.45μm过滤器

C的媒体。线虫生长和处理
1. 1 M CaCl 2
  1.47g CaCl 2
  将体积调整为10 ml
2. 5 N KOH
  14.028克KOH
  将体积调整为50 ml
3. 1 M MgSO 4
  12.324g MgSO 4
  将体积调整为50 ml
4. 胆固醇溶液
  在99.5％乙醇中5mg / ml 过滤灭菌
5. 1M磷酸钾缓冲液pH 6.0（KPO 4 ）
  120g KH 2 PO 4
  27.55克K 2/2 HPO 4 / 3H 2/1 / 1L
  用1M K 2 HPO 4
  调节pH至6.0 高压灭菌器
6. 丰富的线虫生长培养基（RNGM）
  1.5克NaCl
  7.5 g琼脂糖
  3.75克Bacto蛋白胨每500毫升
  高压灭菌器
  冷却至不到55°C，然后加入：
  500μl胆固醇
  500μl1M MgSO 4
  500μl1M CaCl 2
  12.5ml 1M KPO 4缓冲液
  在分配到所需尺寸的培养皿之前仔细混合干燥板在室温下储存在4°C
7. LB琼脂
  2.5克细菌琼脂
  每250毫升5个LB片剂
  高压灭菌器
  储存于4°C
8. 2x YT媒体
  1.6克Bacto蛋白胨
  1克细菌酵母提取物每100ml 100ml 0.5g NaCl 高压灭菌器
  储存于4°C
9. M9缓冲区
  5克NaCl
  15.12g Na 2 HPO 4 <7H 2 O O
  3g KH 2/3 PO 4/1/1/1 高压灭菌器
  加入1ml 1M MgSO 4 / / 4
GAG净化缓冲液
注意：用于洗涤和从DEAE柱洗脱的所有缓冲液通过0.45μm过滤器过滤
1. 20％乙醇
  100 ml 99％乙醇调节音量至500 ml
2. 1 M MgCl 2
  2.03g MgCl 2
  将体积调整为10 ml
3. 库存解决方案
  1. 10％Triton X-100
    5毫升Triton X-100（小心，非常黏稠！）
    将体积调整为50 ml
  2. 5 M NaCl
    292.2克NaCl
    将音量调整为1 L
    注意：过滤5 M NaCl是对所有DEAE缓冲区进行过滤的替代方法。
  3. 1 M CaCl 2（见配方A1）
  4. 1 M Tris-HCl
    121.14克Tris
    用6N HCl将pH调节至7.5 将音量调整为1 L
    高压灭菌器
4. 蛋白酶缓冲液（50mM Tris / HCl pH 8.0,1mM CaCl 2，1％Triton X-100） 5 ml 1M Tris-HCl
  100μl1M CaCl 2
  在80ml ddH 2 O上的10ml 10％Triton X-100
  用6M HCl调节pH值
  将体积调整为100 ml
  储存于4°C
5. DEAE洗脱缓冲液（1.5M NaCl）
6. DEAE洗涤缓冲液（0.1M NaCl或0.25M NaCl）
7. DEAE洗涤缓冲液，pH8（50M Tris / HCl pH 8.0,0.1M NaCl）
  25 ml 1 M Tris-HCl
  在400ml ddH 2 O上的10ml 5M NaCl
  用6M HCl调节pH值
  调节音量至500 ml
8. DEAE洗涤缓冲液，pH 4（50mM NaOAc pH 4.0,0.1M NaCl） 25 ml 1 M NaOAc
  在400ml ddH 2 O上的10ml 5M NaCl
  用1M乙酸调节pH值
  调节音量至500 ml
9. 0.1％AgNO 3
  100mg AgNO 3
  将体积调整为100 ml
10. 5x软骨素酶ABC缓冲液（0.2M Tris-醋酸盐pH8.0）
  1.211g Tris在40ml ddH 2 O中的Tris- / / 用1M乙酸调节pH值
  将体积调整为50 ml
11. 2x肝素酶裂解酶缓冲液（10mM HEPES pH 7.0,2mM CaCl 2）
  119.2mg HEPES
  在40ml ddH 2 O上的100μl1M CaCl 2
  用6M HCl调节pH值
  将体积调整为50 ml

致谢

来自瑞典研究委员会（至L.K.），德国学术交流处（至T.D.）和StiftelsenförProteoglykanforskning（至L.K.）的资助得到承认。 GAG纯化由Ledin等人描述，JBC 2004（doi：10.1074 / jbc.M405382200）和修饰用于秀丽隐杆线虫的方案首先由Dierker >等人，Sci。 Rep。2016（doi：10.1038 / srep34662）。

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