材料和试剂

移液器提示，1,000μl（SARSTEDT，目录号：70.762.100）
移液器提示，200μl（SARSTEDT，目录号：70.760.502）
移液头，20μl（生物圈提示20μl中性）（SARSTEDT，目录号：70.1116.200）
过滤嘴，20微升（生物圈 Fil。Tip 20微升中性）（SARSTEDT，目录号：70.1116.210）
24或48细胞多孔细胞培养板，平底，TC处理（VWR，目录号：734-2325或734-2326）
1.5 ml管子
石蜡膜
50ml离心管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
0.2μm无菌过滤器
大载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652335）
1,550psi断裂盘（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652331）
停止筛选（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652336）
三角褐指藻细胞（NCMA Bigelow海洋科学实验室，Bigelow，目录号：CCMP2561启动子培养物）
有效的DH5α大肠杆菌细胞（“自制的”RbCl感受态细胞[效率≥1.0×10 6] / cfu /μg]）
pKS diaCas9-sgRNA质粒（Addgene，目录号：74923）
含有赋予zeocin抗性的ShBle 基因的pAF6质粒（Falciatore等人，1999），
Bsa I-HF限制性内切核酸酶（New England Biolabs，目录号：R3535S）
具有5'TCGA和AAAC突出端的互补寡核苷酸（24nt）（用于创建用于靶向感兴趣的基因的衔接子）。定制DNA寡核苷酸可以从Sigma-Aldrich
订购
向导® SV凝胶和PCR清洁试剂盒（Promega，目录号：A9282）
T4 DNA连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202S）
ExTaq DNA聚合酶和缓冲液系统（AH Diagnostics）（Takara Bio，目录号：RR001A）
QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27106）
补充有f / 2-Si，1％（w / v）琼脂板的50％（v / v）海水板
钨M10或M17微载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652266或1652267）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
70％（v / v）和100％EtOH
70％（v / v）异丙醇
补充有f / 2-Si，1％（w / v）琼脂平板，100μg/ ml zeocin的50％（v / v）海水板
Zeocin（InvivoGen，目录号：ant-zn-5p）
TOPO ® TA克隆®测序试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：450030）
LightCycler 480高分辨率熔融主试剂盒（Roche Molecular Systems，目录号：04909631001）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
Trizma ®碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
乙二胺四乙酸酸二钠盐（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
胰蛋白胨（VWR，目录号：26208.297）
细菌酵母提取物（BD，Bacto TM，目录号：212750）
细菌琼脂（VWR，目录号：84609.5000）
氯化钠（NaCl）（Merck，目录号：106404）
裂解缓冲液（用于裂解三角褐指杆细胞的缓冲液）（参见食谱）
LB培养基（参见食谱）
含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB琼脂平板（参见食谱）
f / 2具有天然（或人工）海水的生长培养基（参见食谱）（Guillard，1975）

设备

NanoDrop ND-1000或ND-2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM 1000或NanoDrop TM 2000） br />
加热块（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：88870005）
水浴（Grant Instruments）
微量移液器（Eppendorf，型号：Eppendorf Research ®，变量）
台式离心机（Fisher Scientific，型号：accuspin TM Micro 17R，目录号：13-100-676）
孵化器（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® 44，目录号：M1282-0002）
无菌台（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Holten Horizontal Laminar Airflow）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM，目录号：1861096）
LightCycler ®96实时PCR系统（Roche Molecular Systems，目录号：05815916001）
生物学PDS-1000 / He颗粒递送系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2257和165-2250LEASE至165-2255LEASE）
涡流
高压灭菌器
冰箱

软件

LightCycler ® 96软件版本1.1（Roche Molecular Systems）

程序

选择Cas9靶位点
1. 使用定制或公开提供的CRISPR / Cas9目标发现工具（例如，PhytoCRISP-Ex [Rastogi等人，2016]）来鉴定Cas9靶位点（N < sub-20-NGG），与其他基因组基因座具有低或不同源性。感兴趣的基因应该在选择靶位点之前进行测序，或使用RNAseq数据检查多态性，因为未发表的单核苷酸多态性是“P”中的常见发现。三角褐斑基因组。
2. 订购具有20个互补nt和5'TCGA和AAAC突出端的24个长的寡核苷酸，用于创建用于靶向感兴趣的基因的适配器（图1）。
  可选：目标站点的长度可以为±2 bp。
  
  图1.具有5'TCGA和AAAC突出端的适配器示例
将感兴趣靶标的适配器连接到pKS diaCas9-sgRNA质粒中
1. 利用载体（图2）中立即5'-位置的两个Bsa I限制性位点将衔接子与5'-TCGA和5'-AAAC突出端连接到pKS diaCas9中-sgRNA质粒（Nymark等人，2016）。在与5μl10×CutSmart缓冲液（NEB）和不含DNA酶的水反应中将2μg具有1μlBsa I-HF（20,000U / ml，NEB）的pKS diaCas9-sgRNA质粒消化至总反应体积为50μl。在37℃下孵育≥2小时或过夜，以确保在产生不相容的末端的Bsa I限制性位点处完全消化质粒DNA。在65℃下热灭活I-HF酶20分钟。使用Wizard ® SV Gel和PCR Clean-Up Kit（Promega）清洁消化反应。通过使用NanoDrop分光光度计测量260nm处的吸光度来估计线性化质粒浓度。
  
  图2. pKS diaCas9-sgRNA质粒的示意图。将硅藻土密码子优化Cas9 置于岩藻黄质叶绿素a / c结合基因（LHCF2）的启动子的控制下，并且sgRNA的表达是由
  P驱动。三角褐质 U6启动子。两个Bsa 我切割位点位于sgRNA盒内，以使得能够插入用于靶向感兴趣的基因的小适配器（Nymark等人，2016）。 >
2. 通过设置含有1μg每种寡核苷酸，5μl10×T4连接酶缓冲液（NEB）和不含DNA酶的水，使总反应体积为50μl的退火反应来退火寡核苷酸。在加热块中将85℃的退火反应温育10分钟，以破坏每个寡核苷酸内的任何二级结构。通过关闭加热块，同时将加热块中的退火反应离开管，将反应缓慢冷却至室温（〜60-90分钟）。由于在互补寡核苷酸之间形成新的氢键，缓慢冷却便于杂交。（或者，退火反应可以在温度为1℃/分钟的温度下在85℃温育10分钟后降至室温的热循环仪中进行）。
3. 使用摩尔向量插入比例为1:20将适配器连接到线性化的pKS diaCas9-sgRNA质粒中。使用1μlT4 DNA连接酶（400,000 U / ml; NEB）和2μl10x T4 DNA连接酶缓冲液（NEB），在总反应体积为20μl的条件下，于16℃设置连接反应1 h。加热使反应在65℃灭活10分钟。
4. 在冰上冷却，并将5μl连接反应转化成感受态细胞（例如，有感受力的DH5α大肠杆菌细胞）。
5. 对转化的E进行PCR集落筛选。大肠杆菌细胞。为了鉴定包含感兴趣的插入片段的pKS diaCas9-sgRNA质粒，使用用于产生衔接子的寡核苷酸作为正向引物与作为反向引物的载体特异性引物（例如，通用的） M13反向[-29]引物[5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3']）。注意：筛选4-8个细菌菌落通常足以鉴定含有适配体的pKS diaCas9-sgRNA质粒。
6. 从转化的大肠杆菌细胞中分离含有正确插入片段的pKS diaCas9-sgRNA质粒（例如，QIAprep Spin Miniprep Kit [QIAGEN]）。在硅藻细胞的生物弹性转化制备过程中，相对高的浓度（> 400-500ng /μl）优选用于涂覆钨颗粒。
  注意：为了达到这样的浓度，可能需要沉淀10-15ml的细菌培养物，因为pKS diaCas9-sgRNA质粒的产量通常很低。
将pKS diaCas9-sgRNA质粒导入到P的生物学转化。三角褐斑细胞
注意：三角肌细胞可以在宽和轻的条件下生长。建议的生长条件：16小时光周期，22℃，65μmol/秒秒 1 。
1. 第一天
  1. 收获。通过离心（4,500xg，10分钟）处于指数生长阶段的三角褐质细胞。去除上清液并将细胞重悬于f / 2培养基中，得到1×10 8细胞/ ml的浓度。将500μl高密度细胞悬浮液在补充有f / 2-Si的50％（v / v）海水1％（w / v）琼脂平板上扩散。让细胞悬浮液在无菌罩中干燥（约15-30分钟）注意：三角褐斑细胞应保持指数生长期（细胞密度〜0.2-2×10 6细胞/细胞/ ml） 1-2周前进行生物弹性变换。可以使用计数室或流式细胞仪通过手动计数检查细胞编号。只要细胞在进行生物弹性变换之前的时期内保持良好，收获当天的细胞数量对转化效率似乎并不重要。细胞数约为如上所述，在细胞密度上升浓度之前优选0.5-1.5×10 6细胞/ ml。
  2. 转移琼脂平板与P。三角褐斑细胞向生长室（16小时光周期，22℃，65μmol/平方米）至保存时间过夜。
2. 第2天
  注意：精确地按照Biolistic PSD-1000 / He Particle Delivery System手册（Bio-Rad Laboratories）中描述的方式精确地进行微生物体的制备和包被以及对于生物射弹轰击过程所需的所有材料和设备的洗涤/灭菌。。
  1. 旋转含有3毫克洗涤的微载体（钨M10或M17 [Bio-Rad Laboratories]）的50μl等分试样5分钟，以破坏附聚颗粒。
  2. 继续涡旋，同时按以下顺序加入2.5μgpKS diaCas9_sgRNA和2.5μgpAF6质粒DNA（质粒DNA的最大总体积≤10μl），50μl2.5M CaCl 2和20μl0.1M亚精胺（游离碱，组织培养级）。继续涡旋3分钟。
  3. 让微载体沉降1分钟
  4. 短时间（〜2秒）在微量离心机中旋转管子，使钨颗粒成粒。
  5. 去除上清液
  6. 加入140μl70％（v / v）乙醇，并通过移液（无混合或离心）再次取出
  7. 加入140μl100％乙醇，并通过移液（无混合或离心）再次除去
  8. 加入50μl100％EtOH。
  9. 通过仔细点击管子几次重悬。
  10. 当以低速涡旋时，除去10微升的涂覆的钨颗粒，并使用10-200微升的移液管在大载流子的中心扩散颗粒。重复此步骤四次（载入总共五个宏载波）。乙醇从大载体蒸发后，根据制造商的说明书（Biolistic PSD-1000 / He Particle Delivery System manual，Bio-Rad Laboratories）组装进行轰击所需的所有部件。使用1550psi的破裂片，并在插入保持盖之前，将它们在70％（v / v）异丙醇中短暂浸泡（〜1-2秒），对破裂片进行灭菌。
  11. 将目标架放在含有P的琼脂板上。在轰炸室内的停止屏幕（2级）以下6厘米处的三角锥细胞。
  12. 将轰炸室中的真空度设置为26.5 psi。
  13. 轰炸相同的琼脂板五次。每次拍摄后，标记冲击区域，并更改板的位置，以确保随后的拍摄在纸张的另一部分投放。
  14. 将板返回生长室至少24小时。
3. 第三天
筛选CRISPR / Cas9诱导突变（见图3，筛选程序概述）
注意：为避免PCR产品污染，在准备和执行高分辨率熔融（HRM）分析时，应使用过滤器吸头。

图3.检测CRISPR / Cas9诱导突变的筛选程序概述。 A.等待2-4周后，用pKS diaCas9- sgRNA质粒用于菌落出现在选择板上; B.将所需数量的推定的突变菌落转移到24孔或48孔板中。生长细胞1-2周。 C.从每个孔中取出少量细胞并裂解细胞; D.使用裂解物作为模板，通过PCR扩增靶位点周围的500-1,000bp区域; E.通过凝胶电泳检查PCR产物，鉴定大型indels; F.稀释PCR产物1：4×10 6。 G.进行人力资源管理分析以检测较小的indel。在PCR反应中使用来自（F）的稀释的PCR产物作为模板，其扩增靶位点周围约100bp的区域。 H.分析人力资源管理数据。通过研究突变体和WT样品之间的融合温度差异，识别CRISPR / Cas9诱导突变的样品。 I.通过测序确认HRM分析检测到的突变
1. 高分辨率熔融（HRM）分析的准备工作
  1. 挑取转化的菌落并将其转移到含有50μg/ ml zeocin的含有f / 2培养基的24或48细胞多孔细胞培养板（VWR）中。
  2. 大约1-2周的生长，将少量细胞（100-200μl）转移到1.5ml管中。
    注意：除HRM分析中用作对照的转化细胞外，还包括三角褐指杆菌野生型（WT）样品。
  3. 以17,000 x g离心1分钟，并除去上清液
  4. 加入20μl裂解缓冲液（参见食谱）并旋涡30秒
  5. 将管放在冰上15分钟
  6. 将管转移到加热块，并在85℃下孵育10分钟。
  7. 用无DNA酶的水稀释裂解物1：5，并短暂离心以沉淀细胞碎片。稀释的裂解液可以直接用作PCR的模板或-20℃储存
  8. 通过PCR扩增大小约为使用步骤D1g的裂解物作为模板，围绕感兴趣的靶标500-1,000bp 注意：应将PCR产物的3'末端添加单一脱氧腺苷（A）的DNA聚合酶用于启用后续TOPO PCR产物的TA克隆（Invitrogen）。
  9. 通过琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。可以直接检测到具有大型indel的转化体。基于HRM的PCR检测可用于检测较小的indel（包括单核苷酸indels）
2. 人力资源管理分析
  1. 设计HRM引物，使PCR扩增产物约为围绕目标地点的100 bp。 HRM引物应具有约60℃的退火温度。订购HPLC纯化引物
  2. 将步骤D1h的PCR产物的稀释系列从1:40稀释至1:4,000,000。
  3. 使用LightCycler 480高分辨率熔融主试剂盒（Roche），用1x LightCycler 在20μlPCR反应中使用5μl的1:4,000,000稀释的PCR产物作为模板> 480高分辨率熔融主混合物，200nM正向和反向引物和3.0mM MgCl 2终浓度。在以下循环条件下使用（对于大多数靶序列），在LightCycler 96仪器（Roche）中扩增靶标位点周围约100bp的PCR产物：预孵育10分钟95℃，45循环3步扩增（95℃10秒，55℃10秒，72℃20秒），然后循环高分辨率熔融（95℃，60秒，40℃，60秒，65度） C，持续1秒，最后使用斜率0.07°C /秒，采集模式设置15个读数/秒，达到目标温度95°C [1秒]）。每个样品包括2-3个技术重复。
  4. 使用LightCycler 96软件1.1（Roche）分析原始数据，根据归一化的熔解曲线将样品分组成组（图4）。显示与WT不同的融合峰的样品可能含有由CRISPR / Cas9系统诱导的靶向基因组编辑的结果的indels的PCR产物。
  5. 通过Sanger测序确定HRM分析检测到的突变
    
    图4.以归一化熔融峰表示的HRM数据。紫色线：WT PCR产物的简图。红线：含有单个双重G-插入物的PCR产物的谱图。黄线：含有单一双液A型插入物的PCR产物的谱图。棕色线：含有各种不同大小缺失的PCR产物的混合物的概况
鉴定来源于具有双重突变的单细胞的突变体系注意：由HRM鉴定的含有靶向突变的主要三角褐指菌菌落/培养物通常是具有不同indel的细胞混合物。一些菌落也含有低百分比的WT细胞。因此，单细胞必须与原代培养物分离，以获得具有双重突变的“干净”突变株
1. 将含有突变的三角褐指瘤细胞的500μl高度稀释的细胞悬浮液（〜200个细胞/ ml）扩散到f / 2-Si，1％（w / v）琼脂平板上，100μg/ ml zeocin。
2. 对产生的菌落重复筛选过程（在步骤D1中描述）。
3. 执行TOPO ® TA克隆（Invitrogen）将500-1,000bp PCR产物插入TOPO TA载体（例如，pCR < sup> TM 4-TOPO TA载体[Invitrogen]）以鉴定两种不同等位基因中的诱变事件。如果两个等位基因含有不同的indel，PCR产物的直接Sanger测序将在Cas9靶位点后产生双峰。

数据分析

HRM分析是可以使用LightCycler 96软件1.1（Roche）进行的PCR后方法，其能够基于扩增子的熔点的差异容易地筛选PCR扩增子中的遗传变异。在进行人力资源管理分析时，每个样本至少应包含两项技术重复。在HRM分析之前，应对qPCR原始数据的扩增曲线和熔解曲线进行评估。具有高交叉点（Cp）值的扩增曲线可能含有非特异性PCR产物，应排除30个Cp单位。如果熔解曲线表示WT样品或非模板对照（NTC）中的非特异性PCR产物，则需要优化循环条件。样品之间的交叉点不应超过5个Cp单位。 HRM分析表明的突变必须通过测序确认。

食谱

裂解缓冲液
1％（v / v）Triton X-100
20mM Tris-HCl pH 8
2 mM EDTA
LB培养基/琼脂（每升）
10克胰蛋白胨
5克Bacto酵母提取物
5克NaCl
15克细菌琼脂（仅适用于LB琼脂平板）
f / 2天然（或人工）海水生长培养基（Guillard的硅藻培养基）
过滤海水通过0.2μm无菌过滤器，并在120°C高压灭菌20分钟。高压灭菌后无菌添加f / 2微量元素，维生素和无机营养素（见下文）注意：过滤对于从天然海水中去除无机和有机悬浮颗粒是必要的，而高压灭菌使得足够小的生物通过过滤器的孔径。
股票：
1. 微量元素（每升）
  4.36g NA 2 EDTA
  3.15g FeCl 2·6H 2 O - /
  0.01g CuSO 4·5H 2 O
  0.022g ZnSO 4·7H 2 O
  0.01克CoCl 2·6H 2 O
  0.18g MnCl 2·4H 2 O
  0.006g Na 2 Mo 4 O 2·2H 2 O
  通过0.2μm无菌过滤器过滤灭菌。存放在冰箱（或长期储存的冷柜）中
2. 维生素混合（每升）
  0.0005g氰钴胺素（维生素B 12 ）
  0.1g硫胺素HCl（维生素B 1 ）
  0.0005g生物素
  通过0.2μm无菌过滤器过滤灭菌。存放在冰箱（或长期储存的冷柜）中
3. 30.0g / L Na 2 SiO 3·9H 2 O 通过高压灭菌消毒。存放在冰箱里
4. 75g / L NaNO 3
  通过高压灭菌消毒。存放在冰箱里
5. 5.65g / L NaH 2 PO 4·2H 2 O
  通过高压灭菌消毒。存放在冰箱里。
中等（每升）：
1. 1ml微量元素储备溶液（1）
2. 1 ml维生素混合原液（2）
3. 1ml Na 2 SiO 3·9H 2 O储备溶液（3）
4. 1ml NaNO 3储备溶液（4）
5. 1ml NaH 2 PO 4·2H 2 O储备溶液（5）

致谢

这项工作由Gordon和Betty Moore基金会GBMF 4966授予Atle Bones以及NTNU授权技术计划的资助。

参考

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