材料和试剂

移液器提示
1.5 ml Eppendorf管
灭菌滤纸
用于植物培养的塑料培养皿
幻灯片
盖玻璃
0.45微米过滤器
铝箔
ROP7pro的拟南芥种子：GUS和RopGEF4pro：GUS 线
100％，75％，40％，20％，10％，5％乙醇水溶液
50％甘油（Sangon Biotech，目录号：A100854）
100％甲醇
37％盐酸（12N）
氢氧化钠（AMRESCO，目录号：0583）
乙二胺四乙酸（EDTA）（AMRESCO，目录号：0322）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
铁氰化钾（AMRESCO，目录号：0713）
亚铁氰化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9387）
X-Gluc（Sigma-Aldrich，目录号：B5285）
二甲基甲酰胺（AMRESCO，目录号：0464）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4·H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9638）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：431478）
在0.24N盐酸中的20％甲醇（参见食谱）
7％氢氧化钠中的60％乙醇（见配方）
GUS染色溶液（参见食谱）

设备

Pipetman 100μl（Gilson，目录号：F123615）
Pipetman 1000μl（Gilson，目录号：F123602）
镊子
刷笔
植物生长室（Percival Scientific，型号：CU-36L5）和温室
罐
37℃的培养箱（SANFA，型号：DNP-9052）
显微镜（ZEISS，型号：Axio Imager A1）
水净化系统（去离子水）（EMD Millipore，型号：Elix Essential，5 L）

程序

根据拟南芥生长指南 http://www.bio-protocol.org/e126 。

从3-4周的植物中收获完全膨大的玫瑰花叶，并从叶片的背面剥离表皮条（图1A），用刷笔从条上除去叶肉组织（图1B）。然后将表皮条或叶浸入具有GUS染色溶液的1.5ml Eppendorf管中（参见食谱），并将管保持在37℃，黑暗下16-20小时的培养箱中。

图1.图像显示表皮从叶（A）的背面剥离，并通过刷笔从表皮条上去除叶肉组织（B） />

用1 ml 100％乙醇取代上清液，孵育30 min，重复此步骤2次

用1 ml 75％乙醇取代上清液，孵育5 min

用0.24N盐酸的1ml 20％甲醇替换上清液，37℃孵育15分钟

用1％60％乙醇的7％氢氧化钠代替上清液，孵育15分钟

用1 ml 40％乙醇取代上清液，孵育5 min;用20％，10％和5％乙醇将上清液逐渐取代5分钟。在所有这些步骤之后，叶组织将变成白色，并将样品保持在5％乙醇中

将一滴50％甘油置于载玻片上，并将样品置于甘油溶液中;把盖玻片放在样品上。

在显微镜下观察样品并拍照：

打开显微镜的光源，并将鼻梁旋转到最低功率的物镜上。
将幻灯片放置在显微镜的舞台上，并移动幻灯片将样本放置在镜片下方。
调整粗调焦点旋钮，直至样本对焦为止。
以低功率物镜（4x或10x物镜）扫描幻灯片，将要查看的样品的一部分居中，然后将鼻梁旋转至20x或40x物镜。
调整小调焦旋钮，直到细胞处于对焦状态，并调节光阑，直到细胞具有清晰锐利的对比度
用CCD拍照。

数据分析

如图2所示，保护细胞中的GUS信号在来自叶（图2C）和RopGEF4pro：GUS 线的表皮条（图2D）的GUS染色的图像中非常清楚。结果与Li和Liu（2012）报道的保卫细胞中RopGEF4的特异性表达一致。然而，由于叶肉组织的强烈背景，GAS信号在染色整个ROP7pro：GUS 线条时不清楚（图2A）。当表皮条与叶肉细胞分离时，GUS染色后可以看到明显的保护细胞GUS信号（图2B）。当应用这种方法时，最好使用拟南芥3-4周龄的植物，因为在此期间表皮条很容易从叶肉组织中剥离。该方法适用于在拟南芥保卫细胞中表达的任何基因，或其他植物，表皮条可以容易地从叶上剥离。

图2.来自 ROP7pro：GUS 线和叶（A）的叶（A）和表皮条（B）的GUS染色， C）和表皮条（D）来自 RopGEF4pro：GUS 线。比例尺= 10μm。

笔记

请仔细保持每个步骤中的表皮条在管中，尽量避免在去除上清液时丢失表皮条。
GUS染色手术后，表皮条变软，容易断裂，所以要非常小心地将载玻片上的表皮条铺平。

食谱

在0.24N盐酸中的20％甲醇
混合：
20毫升100％甲醇
2ml 37％盐酸（12N）去离子水78 ml
60％乙醇在7％氢氧化钠中将28 g氢氧化钠溶于去离子水中至100ml，制成28％氢氧化钠混合：
60毫升100％乙醇
25毫升28％氢氧化钠
15毫升去离子水
GUS染色溶液
100mM磷酸钠缓冲液（pH = 7.0）
10 mM EDTA
0.1％Triton X-100
0.5 mM铁氰化钾
0.5mM亚铁氰化钾
1mM X-Gluc

将0.8892g X-Gluc溶于100ml二甲基甲酰胺中以制备20mM储备液，并保持在-20℃的黑暗中
制备200mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）：溶解1.08g磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4·H 2 O）和3.27 g磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4·7H 2 O）在去离子水中最多可加入100ml
混合：
50ml 200mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）
2 ml 500 mM EDTA溶液
0.5ml 20％（w / v）Triton X-100
1毫升50毫摩尔铁氰化钾 1毫升50毫摩尔亚铁氰化钾 5 ml 20 mM X-Gluc
用去离子水加至100毫升
过滤灭菌（0.45微米过滤器）并保持在4℃用铝箔包裹

致谢

这项工作得到了中国国家科学基金（授予号为31571450）的支持。该方案根据Pecinka等人（2009）进行了修改。

参考

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