材料和试剂

剃刀刀片
210μm尼龙网（A.Hartenstein，laborversand.de，目录号：PAS1）
来自工艺品店的塑料刺绣环（图1）
注意：将尼龙网放置在塑料刺绣环中，为网状物提供一点张力，使其更容易倒入混合水中，并通过网格保护细胞富集的碎片。

图1.带有塑料刺绣环的尼龙网
纸巾
小型医用刮刀或塑料勺子
1.5毫升管或铝箔
拟南芥植物
Milli-Q或蒸馏水保持在4°C
碎冰
液氮

设备

搅拌机（Braun JB 3060或其他800 W搅拌机）（Braun家用，型号：JB 3060）
注意：已尝试使用效果较差的搅拌机，但无法分离出适当的碎片，可能是由于没有足够的力量来完全粉碎冰块。
显微镜（ZEISS，型号：SteREO Discovery.v20）

程序

在12小时/ 12小时光周期内从4-7周龄的拟南芥植物中收集叶子，每株植物使用17-18株和4-5株。如果植物的尺寸较小，则每株植物需要更多的叶子。

用剃刀刀片去除中央静脉（中脉）。收集大约1.0-1.5 g的叶子，不需要上述步骤（图2）

图2.使用剃刀刀片切割并删除中脉
将切割的叶片放入搅拌机中，加入250毫升冷的Milli-Q水和少量碎冰。
混合1分钟（Braun搅拌机的程序2），通过网格倒入塑料刺绣箍中。
注意：通过网格进行缓慢进行，使得保护细胞富集的碎片被收集在网格的中间。这在第7步特别重要，之后收集样品。
用搅拌杯上方的冷Milli-Q水清洗网孔，使保护细胞富集的碎片转移到搅拌杯内。将冷的Milli-Q水加至250毫升和少量碎冰。
混合1分钟（程序2），将网眼放在塑料刺绣箍中。
用搅拌杯上方的冷Milli-Q水清洗网孔，使保护细胞富集的碎片转移到搅拌杯内。将冷的Milli-Q水加至250毫升和少量碎冰。
混合1分钟（程序2），将网眼放在塑料刺绣箍中。
从浅绿色的表皮部分去除残留的深绿色组织碎片（尚未混合的小叶片）
用纸巾约10-15秒，用多余的水将网眼的下面干净，并用小铲或塑料勺子将样品小心地刮到1.5毫升管或铝箔上（图3）。

图3.将收集到1.5ml管中的保护细胞富集样品
将样品在液氮中冷冻并保持在-80°C。或者，样品可立即用液氮研磨，用于RNA分离的粉末注意：如果需要对保卫细胞富集的估计，一个容易的控制是从用于保护细胞富集的同一植物中收获全叶样品并在液氮中冷冻并储存在-80℃。然后可以将RNA与保卫细胞样品并行提取。保护细胞富集水平可以通过使用保卫细胞优先表达基因例如HT1（AT1G62400），OST1（AT4G33950）或GORK（AT5G37500））的实时定量PCR来估计。

数据分析

可以用立体显微镜（Zeiss SteREO Discovery.v20）显现分离的保护细胞富集的片段，并且不应存在叶绿素片段（绿色组织）（图4A）。在测试不同的搅拌机时，用Braun（800W）搅拌机实现了成功分离富集保卫细胞的碎片，但是没有使用效果较差的搅拌机（图4）。

图4.在显微镜下分离的保护细胞富集碎片。：一种。用Braun搅拌器分离样品; B.用小型220W搅拌机分离的样品。

为了控制保卫细胞富集的质量，可以通过比较其保守细胞富集的表达水平，通过保卫细胞表达的基因，如HT1和GORK 进行实时定量PCR样品与全叶样品（图5;有关qPCR条件的详细信息，参见Jalakas等人，2017）。

图5.与叶样品相比，Col-0保守细胞富集样品中的基因表达。显示三个生物重复的平均值;误差条描绘±SEM。

致谢

这个协议是从研究文章Bauer等人（2013）改编而成。这项工作由爱沙尼亚科学和教育部（IUT2-21 to HK），欧洲区域发展基金（CEMCE到香港分子细胞工程中心），芬兰科学院（拨款号码：307335，中心卓越初级生产者2014-2019至MB）。

参考

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Bauer，H.，Ache，P.，Lautner，S.，Fromm，J.，Hartung，W.，Al-Rasheid，KA，Sonnewald，S.，Sonnewald，U.，Kneitz，S.，Lachmann，，孟德尔，RR，Bittner，F.，Hetherington，AM和Hedrich，R。（2013）。＆nbsp; 降低相对湿度的气孔反应需要保卫细胞自主的ABA合成。 23（1）：53-57。

Jalakas，P.，Huang，Y.-C.，Yeh，Y.-H.，Zimmerli，L.，Merilo，E.，Kollist，H.andBrosché，M.（2017）。＆lt; a class = “ke-insertfile”href =“https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28330935”target =“_ blank”>拟南芥中对ABA1（ERA1）的增强反应的作用气孔反应超出ABA信号。植物生理学174：665-671。

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