材料和试剂

剃刀刀片
显微镜玻片（Thermo Fisher Scientific，Superfrost，目录号：10143560WCUT）
封面24 x 60 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：15747592）
堆肥（Proveen，目录号：14926）
花椰菜（Brassica oleracea） var。 botrytis ，品种Clovis，Vilmorin）
注意：植物在受控温室的堆肥中生长（短日照条件9小时光照;温度22℃;相对湿度70％）。接种后，将它们在100％相对湿度下放置在微型温室内的受控温室中24小时。 24小时后，取下盖子。所有的实验都使用了来自四周龄植物的第二个真叶。
菌株8004 :: gus-GFP （Xanthomonas campestris pv。（ Xcc >）; Cerutti et al。，2017）
氯化镁（MgCl 2）（Merck，目录号：814733）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）
Casamino acids（BD，BD Biosciences，目录号：223050）
磷酸氢二钾（K 2）HPO 4（Merck，目录号：105101）
七水硫酸镁（MgSO 4•7H 2 O）（Merck，目录号：105886）
Silwet L-77（CAAHMRO，目录号：115950H）
Calcofluor（荧光增白剂28）（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
MOKA中等（见食谱）

设备

从花园中心购买的微型温室（Nortene，目录号：ME673714）
空心冲孔机（Harris，Uni-Core）（Electron Microscopy Sciences，目录号：69039-70）或剃刀刀片
配有氩激光（488nm的射线），633nm的氦氖激光器和405nm的二极管激光器的共聚焦显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP2或Leica TCS SP8）
工作距离长（NA = 0.8，工作距离为3,300μm）的水浸透镜40x（Leica Microsystems，目录号：506155）或具有长工作距离（NA = 0.9，工作距离为2900μm）的水浸透镜63x ）（Leica Microsystems，目录号：506148）（Leica Mannheim，Germany）

程序

通过将1ml MgCl 2的细菌悬浮液（10μg/ ml）中的浸泡叶（来自四周花椰菜的第二个真叶）接种15秒钟， >和0.02％Silwet L-77（参见图1A）。细菌先前在MOKA培养基中生长（参见方案1）。轻轻地移动溶液中的叶子，以改善叶子的湿润度
将植物放置在闭合的微型温室中，浇水（温室内1-2厘米的水），并将其保持在生长室中100％的相对湿度（见图1B）。 24小时后，取出盖子并将植物放回生长室（9小时光照; 22℃，相对湿度70％）。

图1.花椰菜叶的接种程序。：一种。通过将第二真叶浸入细菌悬浮液进行接种; B.将花椰菜植物浸泡在微型温室中24小时后放置
在感染后的给定日期（3和6dpi），取片（1/2叶或直径0.5cm，如图2所示）的叶片（包括水合物的边缘）并将样品安装在玻璃载玻片上的水中（图2 ）。识别要观察的面（近轴，叶的上侧，或背面，叶的下侧），可以观察到两侧。用盖子覆盖样品，轻轻地加入几滴calcofluor水溶液（0.01％）。
注意：在添加calcofluor之前，检查405nm处的自发荧光水平。有时，表皮细胞壁的发射自发荧光足以使叶片成像。

图2.安装在玻璃载玻片上的花椰菜叶子样品。A.花椰菜叶片的背面仅用刀片切割; *：Hydathode。白色圆圈表示用于观察的区域，如B和C所示。B和C.具有中空冲头的叶盘样品，叶片边缘具有一个阴极（*）。（B）近轴（叶的上侧）和（C）背面（叶的下侧）视图。比例尺= 2.5毫米。
为了使表达GFP的细菌定位感兴趣区域，使用GFP滤光片（蓝色范围内激发，以及525±25nm的发射滤光片）检查在荧光下的显微镜（通过眼睛）的制备。使用10x物镜快速观察样品。然后使用40x或60x水浸透镜来获取图像和z叠层。
在共聚焦模式下，使用405nm处的二极管激光器来收集由calcofluor发射的荧光（在410-470nm之间），即氩激光的488nm线，以收集在500和540nm之间的GFP荧光和633nm HeNe激光的X射线以收集叶绿素的自发荧光（在640和680nm之间）（图3）。
调整每个荧光通道的设置（用于激发的激光功率）和光电倍增管（PMT）的增益，以避免PMT检测器过度曝光（图3）。

图3. SP2 AOBS共聚焦显微镜的控制面板。左侧部分对应于采集calcofluor和叶绿素荧光的设置。二极管激光器的405nm线（白色箭头）用于激发calcofluor（激光器的功率可以从二极管的额定功率的1到100％调制，这里的值是99％）。使用氦氖激光器的633线（黑色箭头）来激发叶绿素（功率激光器在激光器的额定功率的70％）。徕卡共焦点配有光谱模块。通过PMT-1（蓝色通道），由calcofluor发出的荧光收集在410和470nm之间，并且由PMT-3（红色通道）收集叶绿素发射的荧光在640和680nm之间。正确的部分对应于单独采集GFP的设置，使用氩激光器的488nm射线（白色箭头），功率为激光器额定功率的48％，荧光收集在500和540nm由PMT2（绿色通道）。
使用共焦显微镜的顺序模式，以避免PMT检测器之间的串扰。要做到这一点首先收集calcofluor和叶绿素荧光，接下来是GFP荧光，如上所示（图3）。以400 Hz的速度获取图像（512 x 512像素），平均值为0到8（取决于细菌运动的速度）（见图4）。
对于z-stack采集，定义显微镜galvo阶段的顶部和底部位置，z步骤接近0.5μm。在z维上获得的10到25个共聚焦平台（使用徕卡软件）进行最大投射（见图4）。

图4.在孔隙水平上表达 Xcc 的GFP的共聚焦图像A.在z-维度上获得的15个共焦面的最大投影，z-步长为0.5μm，线平均值为2. B.从z维度获得的z-step为0.5μm，线平均值为4的20个共聚焦平面的最大投影。C.在z轴上获得的25个共焦面的最大投影，尺寸为z-step为0.5μm，无线平均。箭头表示孔。蓝色对应于表皮细胞壁表面的calcofluor染色的发射荧光，绿色对应于表达GFP的细菌，红色对应于叶绿素。比例尺= 30μm

食谱

MOKA中等
注意：细菌在30℃下在MOKA培养基中生长过夜。通过离心（4,000×g，10分钟）从培养基中收获并悬浮于1mM MgCl 2和0.02％Silwet L -77 at 108 cfu ml -1 。在蒸馏水中1升：
4克酵母提取物 8克酪蛋白氨基酸
2g K 2 HPO 4
0.3g MgSO 4•7H 2 O→/ /

致谢

这项工作得到法国国家教育和研究部授予AC的博士资助。 LIPM是法国卓越实验室项目（TULIP ANR-10-LABX-41; ANR-11-IDEX-0002-02）的一部分。我们感谢RégionOccitanie对显微镜平台的持续经济支持，LaurentNoël批评阅读手稿。

参考

Cerutti，A.，Jauneau，A.，Auriac，M.C.，Lauber，E.，Martinez，Y.，Chiarenza，S.，Leonhardt，N.，Berthomé，R.andNoël，L.D。（2017）。花椰菜水合物的免疫力通过黄单胞菌（Xanthomonas campestris）控制全身感染 pv 。植物生理学 174（2）：700-716。