材料和试剂

显微镜玻片（Thermo Fisher Scientific，Superfrost，目录号：10143560WCUT）
封面24 x 60 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：15747592）
剃刀刀片
花椰菜（Brassica oleracea） var。，葡萄品种Clovis）
注意：
1. 花椰菜植物在受控的温室中生长。
2. 所有的实验都使用了四周龄植物的第二个真叶。
水合氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：23100）
甘油（C 3 H 8 O 3）（VWR，目录号：24387.326）
Calcofluor（荧光增白剂28）（Sigma-Aldrich，目录号：F3543）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
二甲胂酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：C4945）
戊二醛EM级（电子显微镜科学，目录号：16214）
四氧化锇（OsO 4）（Electron Microscopy Sciences，目录号：19150）
乙醇（C 2 H 5 OH）（Sigma-Aldrich，目录号：32221）
Epon（Electron Microscopy Sciences，目录号：14120）
注意：树脂组合物：Embed-812（45g），DDSA（36g），NMA（18g）和BDMA（1.35ml）。加速器DMP30被BDMA替代的嵌入试剂盒（Electron Microscopy Sciences，catalog number：11400）。
硼砂（Sigma-Aldrich，目录号：B3545）
甲苯胺蓝（RAL Diagnostics，目录号：361590）
亚甲基蓝（Merck，目录号：159270）
基本品红（Sigma-Aldrich，目录号：857343）
周期酸（VWR，Prolabo，目录号：20.593.151）
乙酸（CH 3 COOH）（CARLO ERBA试剂，目录号：302016）
硫代碳酰肼（Sigma-Aldrich，目录号：223220）
蛋白质银（用于组织学的Roques）（Sigma-Aldrich，目录号：05495）
Aceton（CH 3 COCH 3）（Fisher Scientific，目录号：10395640）
澄清解决方案（见配方）
固定液（参见食谱）
二甲胂酸钠缓冲液（见食谱）
硼烷溶液与甲苯胺蓝和亚甲蓝（见食谱）
基本品红解决方案（请参阅食谱）
周期酸溶液（见配方）
银蛋白溶液（参见食谱）

设备

空心冲孔机（Harris，Uni-Core）（Electron Microscopy Sciences，目录号：69039-70）
超切片机（Leica Microsystems，Reichert-Jung，型号：UltraCut E）
用于Nomarski的光学显微镜（Leica Microsystems，型号：DM IRB-E）
配有405nm二极管激光器的共焦显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP2）
隔膜泵真空或其他真空源
搅拌器电热板（IKA）
微波设备（Leica Microsystems，型号：EM AMW）
平底嵌入胶囊（电子显微镜科学，目录号：70021）
烤箱（Memmert，型号：UFE500BO）
Histo金刚石刀（Diatome Histo）用于半薄片（0.5μm）至光学观察
超级金刚石刀（Diatome Ultra 45）用于超薄切片（70-80nm）至透射电子显微镜
热板（幻灯片加热器）（C＆amp; A Scientific，Premiere，型号：XH-2002）
光学显微镜（ZEISS，型号：Axioplan 2）
CCD相机（ZEISS，型号：AxioCam MRc）
透射电子显微镜（日立，型号：HT7700）
金网格（电子显微镜科学，目录号：FCF200-Au）

软件

Pro Plus 4.0成像软件（Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA）

程序

Nomarski和共聚焦显微镜用于观察澄清的厚样本，分别描绘复杂的血管形成和外膜。透射光（薄切片）和透射电子显微镜（超薄切片）的光学显微镜用于定位阴茎内的两种细菌，以及感染期间细胞或组织结构的变化。

澄清Nomarski和激光共焦显微镜的样品
1. 使用空心打孔刀或刀片刮刀片。
2. 将样品浸入基于水合氯醛的澄清溶液（见配方1）中，在4℃（黑夜）（冰箱）中浸泡数周（通常为1-3周）。
3. 将样品装入相同的溶液中，由Nomarski显微镜观察。获取图像（见图1）。
  
  图1.在Nomarsky获得的花椰菜（A）和拟南芥（B）的典型图像（）。比例尺= 100μm。
4. 对于同一样品的共焦显微镜，在4℃的蒸馏水中冲洗样品过夜。
5. 将样品在0.01％的calcofluor（用于纤维素）的水溶液中在室温下染色1小时。
6. 用蒸馏水冲洗并放在玻璃载玻片上的水中。
7. 使用激光二极管的405nm射线捕获图像，并收集410和500 nm之间的发射荧光。样品很厚，我们使用长工作距离的物镜，以避免在观察和采集过程中对样品施加过大的压力。因此，我们倾向于使用水浸式物镜（工作距离2至3 mm）进行深度观察（见图2）。
  
  图2.花椰菜水合物的真皮光学切片的共焦平面（A-B）。A.具有两个孔（箭头）和孔下方的大室（开口箭头）的水阴极边缘的视图。 B.具有多种口腔的水溶性阴道的上皮组织的图像。 e：表皮细胞; p：薄壁组织细胞C.在阴茎内的20个共焦平面（z-叠层）的最大投影，以描绘组织的气管及其装饰。比例尺= 25μm
电子和光学显微镜样品制备
1. 用剃刀刀片，取包括水合物的叶片边缘（2-3毫米 2 ）。
2. 用固定溶液将样品固定10分钟（参见方案2）。缓慢释放真空并重复（2-3次），直到样品沉没。
3. 在没有Triton X-100的固定溶液中，在大气压下固定样品1小时。
4. 在0.2M二甲胂酸钠缓冲液中冲洗样品三次（每次15分钟，参见方法3）。
5. 在0.2M二甲胂酸钠缓冲液中用2％四氧化锇将样品固定1小时。
6. 在0.2M二甲胂酸钠缓冲液中冲洗样品三次（每次15分钟）
7. 以等级系列的乙醇浓度水溶液（25％，50％，每次处理1小时）使样品脱水。
8. 保存乙醇中的样品70％（最少1 h），直到使用徕卡微波设备（AMW）脱水并渗入Epon树脂（渗透按照以下程序进行，见表1）。
  
  表1.树脂渗透程序
  
  注意：
  1. *斜率：表示温度逐渐升高以在时间结束时达到指定值。
  2. 连续：表示温度尽快达到指定值，然后维护 d。
9. 将样品放在装有纯树脂的平底嵌入胶囊中，在60℃下在烘箱中聚合48小时。
对于光学显微镜
1. 用Histo-diamond刀切成厚度为0.5μm的树脂嵌入样品。将这些部分放置在玻璃载玻片上的一滴水上，并在热板上加热至50℃以干燥并粘在玻璃上。
2. 通过在含有0.1％甲苯胺蓝和0.2％亚甲蓝的1％硼砂溶液（参见方案4）中覆盖载玻片来污染切片（使用这两种污渍对比来自树脂嵌入样品的薄片）。在水中冲洗，然后用0.07％碱性品红的水溶液覆盖载玻片（用于染色酸性化合物，参见配方5）。
3. 使用配有CCD彩色相机（ZEISS，AxioCam MRc）的光学显微镜（ZEISS，Axioplan 2成像）获取图像（参见图3）
  
  图3.来自由XCC 菌株8004 :: 感染的花椰菜叶（3dpi）的树脂嵌入的水合物（AB）的树皮剖面（0.5μm厚） em> GUS-GFP （Cerutti等人，2017）。 e：表皮细胞; p：外膜组织的薄壁组织细胞; xv：木质部容器A.注意孔（箭头），孔下方的大室（开口箭头）; B.细菌在口腔中的存在（箭头）。比例尺= 25μm
对于透射电子显微镜
1. 切割厚度为70-80nm的树脂嵌入样品，并收集金网上的切片，并在高碘酸 - 硫代碳酰肼 - 银（Ag）蛋白质（PATAg）处理之前将其干燥过夜。
2. 在1％（w / v）的高碘酸水溶液中，将部分（网格）在室温下漂浮30分钟（参见方案6）。
3. 在蒸馏水上冲洗两次两小时（每次1小时）。
4. 在4℃下用含有0.2％硫代碳酰肼的20％乙酸溶液处理切片过夜
5. 在室温下将各浓度乙酸（20％，10％，5％醋酸溶液至蒸馏水）溶液中的切片洗涤30分钟。
6. 在室温下，在黑暗中将1％（w / v）蛋白质蛋白酶（参见食谱7）的部分漂浮30分钟。
7. 在水中洗涤切片（2-3次，每次20分钟）并风干。
8. 观察在80kV下运行的透射电子显微镜下的部分，并获取图像（见图4）
  
  图4.未感染的阴茎（A）和感染的水阴（来自3dpi的B，6dpi的C）的图像，其由感染了Xcc 菌株8004 :: em的花椰菜叶> GUS-GFP （Cerutti等，2017）。 xv：木质部容器。箭头表示木质部血管的二次细胞壁装饰。箭头表示由细菌定殖的上皮细胞。注意（C）细菌侵入的血管。比例尺= 3μm

数据分析

可以进一步分析来自不同澄清植物样品的水合物的图像以计数木质部终端，以确定不同细胞类型的大小，孔的数量及其每个阴茎的大小。通过对捕获图像的分析，我们将花椰菜和拟南芥的水合物（Cerutti等人，2017年）进行了表征。所有测量均使用Image-Pro Plus 4.0成像软件（Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA）完成。也可以使用其他成像软件，如ImageJ：

为了计算水合物的木质部终端（或孔），最常见的是需要以不同的焦点获取图像，以便可视化所有的终止。使用一种测量工具，可以节省点特征的定位，以避免在阴极内的木质部终端超量计数。分析至少30至40个水阴极（Cerutti等人，2017）。
为了确定细胞（表皮或表皮细胞）的大小（面积），获得良好的图像至关重要。为了解决这个问题，用calcofluor染色细胞壁，并在图像采集之前用水充分冲洗样品。

食谱

澄清解决方案
45克水合氯醛
7.6毫升蒸馏水
9.3 ml 60％甘油
固定解决方案
2.5％戊二醛
0.2 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）
0.1％Triton X-100
二甲胂酸钠缓冲液
0.2M柠檬酸钠溶液（4.28g，100ml）在蒸馏水中，pH7.2 用几滴HCl（1N）调节pH值
硼砂溶液与甲苯胺蓝和亚甲蓝
在1％硼砂的水溶液中加入0.1％（w / v）甲苯胺蓝，然后加入0.2％（w / v）亚甲基蓝色
基本品红解决方案
碱性品红色在蒸馏水中的0.07％（w / v）
周期酸溶液
1％（w / v）的高碘酸在蒸馏水中
银蛋白溶液
准备1％（w / v）蛋白质银在蒸馏水中的新鲜溶液。在烟雾瓶玻璃中，在搅拌下逐渐加入蛋白质银。使用前过滤溶液并将其存储在黑暗中

致谢

这项工作得到法国国家教育和研究部授予AC的博士资助。 LIPM是法国卓越实验室项目（TULIP ANR-10-LABX-41; ANR-11-IDEX-0002-02）的一部分。我们也感谢RégionOccitanie对显微镜平台的财务支持。感谢CMEAB（中心微电子技术公司）的工作人员提供了宝贵的技术援助。固定和嵌入的程序改编自：a）Glauert，A.M。（1975）。固体，脱水和嵌入生物标本在电子显微镜实践方法。北荷兰出版公司阿姆斯特丹。 b）Hawes，C.和Satiat-Jeunemaitre，B.（2001）。植物细胞生物学：实践方法。牛津大学出版社。 PATAg治疗改良自Thiery，J.P。（1967）。 Mise enévidencedes polysaccharides sur coupes fines en microopieélectronique。焦耳; Microsc。 6：927-1018。

参考

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Cerutti，A.，Jauneau，A.，Auriac，M.C.，Lauber，E.，Martinez，Y.，Chiarenza，S.，Leonhardt，N.，Berthomé，R.andNoël，L.D。（2017）。花椰菜水合物的免疫力通过黄单胞菌（Xanthomonas campestris）控制全身感染 pv campestris 。植物生理学 174（2）：700-716。
Glauert，A.M。（1975）。固定，生物标本的脱水和嵌入在电子显微镜的实践方法中。北荷兰出版公司阿姆斯特丹。
Hawes，C.和Satiat-Jeunemaitre，B.（2001）。植物细胞生物学：实践方法。牛津大学出版社。
Thiery，J.P。（1967）。 Mise enévidencedes polysaccharides sur coupes fines en microopieélectronique。 J Microsc 6：927-1018
Perrin，A.（1972）。贡献àl'étudede l'organization et du fonctionnement des hydathodes：recherches anatomiques ultrastructurales et physiologiques。大学克劳德 - 伯纳德里昂。
Singh，S。（2014）。喷雾：量化，微生物学和植物病理学的影响。：Lüttg，U.，Beyschlag，W.，Cushman，J.（Eds）。 PROG。博特。卷。 75. 第187-214页。
Wang，B.，Xu，B.，Wang，H.，Li，J.，Huang，H.，Xu L.（2011）。基因以叶片近轴 - 背面并列的形式表达，并且分别是叶片边缘发育需要。植物生理 157：1805-1819。