材料和试剂

QSP0.1-10μlPIPETTETIP（Thermo Fisher Scientific，Quality Scientific Plastics，目录号：102-Q）
1-200μl新移液器吸头黄（Thermo Fisher Scientific，Quality Scientific Plastics，目录号：TW110-Q）
101-1,000μl移液器吸头蓝（Thermo Fisher Scientific，Quality Scientific Plastics，目录号：111-Q）
1,000-5,000μl移液器吸头天然（Thermo Fisher Scientific，Quality Scientific Plastics，目录号：090-Q）
15毫升离心管（IWAKI，目录号：2325-015）
12孔平底微孔板（IWAKI，目录号：3815-012）
150毫米组织培养皿（IWAKI，目录号：3030-150）
1毫升注射器（TERUMO，目录号：SS-01T）
27 G针（TERUMO，目录号：NN-2719S）
MEF细胞
Immunostar ®试剂（Immunostar; Wako Pure Chemical Industries，目录号：291-55203）
SuperSignal TM West Femto最大灵敏度底物（超信号; Thermo Fisher Scientific，目录号：34096）
链霉抗生物素蛋白Sepharose TM 高性能（SA珠; GE Healthcare，目录号：17511301）
磷酸氢二钠12-水（Na 2 HPO 4 •12H 2 O; Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02835）
二水合磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 •2H 2 O; Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-02815）
氯化钾（KCl; Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
氯化钠（NaCl; NACALAI TESQUE，目录号：31320-34）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ; Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-04245）
硫酸铜（II）（CuSO 4 ; Wako Pure Chemical Industries，目录号：034-04445）
十二烷基硫酸钠（SDS; NACALAI TESQUE，目录号：31606-04）
1,10-菲咯啉一水合物（菲咯啉; Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-00862）
N-乙基马来酰亚胺（NEM; NACALAI TESQUE，目录号：15512-11）
c完整的 TM 蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11836145001
2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES; Dojindo Molecular Technologies，目录号：GB10）
O，O'-双（2-氨基乙基）乙二醇 - N，N，N'，N' - 四乙酸（EGTA; Dojindo Molecular Technologies，目录号：G002）
蔗糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-00015）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris; C 4 H 11 NO 3 ; STAR CHEMICAL，目录号：RSP-THA500G）
甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
Brilliant Green（Wako Pure Chemical Industries，目录号：021-02352）
考马斯亮蓝G-250（CBB G-250; NACALAI TESQUE，目录号：09409-42）
DMEM，高葡萄糖，无谷氨酸，无蛋氨酸，无半胱氨酸（DMEM（cys-）; Thermo Fisher Scientific，目录号：21013-024）
二甲基亚砜（DMSO; Wako Pure Chemical Industries，目录号：045-28335）
2-巯基乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：139-07525）
N-甲基乙氨基乙基甲磺酸盐（MTSEA-生物素;多伦多研究化学品，目录号：B394750）
2-磺酸根合乙基甲磺酸钠（MTSES; Toronto Research Chemicals，目录号：S672000）
2-（三甲基铵） - 甲基硫代磺酸乙酯（MTSET; Toronto Research Chemicals，目录号：T795900）
2-（三乙基铵） - 甲基硫代磺酸乙酯（MTS-TEAE; Toronto Research Chemicals，目录号：T775800）
1,2-Ethanediyl Bismethanethiosulfonate（M2M; Toronto Research Chemicals，目录号：E890350）
1,3-丙二醇二甲硫基磺酸盐（M3M; Toronto Research Chemicals，目录号：P760350）
1,4-丁二基双甲硫基磺酸盐（M4M; Toronto Research Chemicals，目录号：B690150）
1,6-己二基二甲硫基磺酸盐（M6M; Toronto Research Chemicals，目录号：H294250）
3,6-二氧杂辛烷-1,8-二基双甲硫基磺酸盐（M8M; Toronto Research Chemicals，目录号：D486150）
十一烷-1,11-二基 - 双甲硫基磺酸盐（M11M; Toronto Research Chemicals，目录号：U787800）
3,6,9,12-四氧杂十四烷-1,14-二基 - 双 - 甲硫基磺酸盐（M14M; Toronto Research Chemicals，目录号：T306250）
3,6,9,12,15-Pentaoxaheptadecane-1,17-diyl Bis-methanethiosulfonate（M17M; Toronto Research Chemicals，目录号：P273750）
1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS;参见食谱）
1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（1x DPBS;参见食谱）
1x样品缓冲液（样品缓冲液;参见配方）
1x均质缓冲液（见食谱）

设备

0.5-10μl移液器（NICHIRYO，型号：Nichipet EXII，目录号：00-NPX2-10）
2-20μl移液器（NICHIRYO，型号：Nichipet EXII，目录号：00-NPX2-20）
20-200μl移液器（NICHIRYO，型号：Nichipet EXII，目录号：00-NPX2-200）
100-1,000μl移液器（NICHIRYO，型号：Nichipet EXII，目录号：00-NPX2-1000）
1,000-5,000μl移液器（NICHIRYO，型号：Nichipet EXII，目录号：00-NPX2-5000）
Forma Series II Water Jacket CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：3110）
Polytron均质器（日立，型号：HG30）
500瓦超声波处理器（Sonics＆amp; Materials，型号：VCX 500）
小型培养旋转器（TAITEC，型号：RT-50）
高速离心机（Koki Holdings，himac，型号：CF15RN）
高速冷冻微型离心机（TOMY，型号：MX-307）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-90K）
超速离心机固定角度转子（Beckman Coulter，型号：Type 50.4 Ti，目录号：347299）
铝块浴（TAITEC，型号：DTU-1CN）
ImageQuant LAS 4000（通用电气医疗集团）
离心管（Beckman Coulter，目录号：355645）
抹刀

软件

ImageQuant TL 7.0（通用电气医疗集团）

程序

SCAM使用完整的MEF细胞
1. 将表达具有单个cys-突变的靶蛋白的1×10 6个细胞接种到12孔板中，并培养12小时以达到100％汇合。
2. 用1x PBS洗涤细胞一次。
3. 对于标记测定，请跳过步骤A3和A4。对于使用MTSES，MTSET或MTS-TEAE的竞争测定，向每个孔添加终浓度为2mM的竞争者。在光屏蔽条件下将细胞在冰上孵育30分钟。
4. 用1x PBS洗涤未与标记化合物一起孵育的细胞一次。确保不要洗涤与化合物一起孵育的细胞。
5. 用DMEM（cys-）稀释50mM MTSEA-生物素，终浓度为1mM。向每个孔中加入450μlDMEM（cys-）溶液，并在光屏蔽条件下将细胞在冰上孵育30分钟。
6. 用1x PBS洗涤细胞两次。注意不要用水压去除细胞。
7. 用500μl/孔的1％SDS / PBS溶解细胞。在室温下摇动板30分钟。
8. 在冰上超声处理样品（脉冲开/关时间：1秒;振幅：35％）2分30秒。确保将样品超声处理到样品不再粘稠的程度。
9. 使用1x DPBS洗涤SA珠子4次。在1x DPBS中以66％SA珠子与34％1x DPBS的比例洗脱SA珠子。
10. 向每个样品中加入30μl经洗涤的SA珠粒。在室温下旋转过夜。
11. 将SA珠在12,900 x g 下在4℃下离心45秒。除去上清液，加入500μl1％SDS / PBS。重复4次。
12. 通过在100℃下在含有1％2-巯基乙醇的样品缓冲液中煮沸1分钟来洗脱样品。通过免疫印迹分析洗脱的蛋白质。有时，沉淀的珠子和上清液的分离是困难的，因为样品的粘性。在这种情况下，请参阅注释。
MEF微粒体的制备
1. 将具有单/双Cys突变体的表达靶蛋白的细胞接种到15cm培养皿上并培养细胞直至约90％汇合。
2. 用足量的1x PBS洗涤细胞，并用刮刀将细胞收集在5ml /板的1x DPBS中。将来自两个平板的细胞聚集到一个15-ml管中，并通过在4℃下以750×g离心10分钟沉淀并在-80℃下储存直至使用。
3. 将沉淀悬浮于2ml含有cOmplete TM 蛋白酶抑制剂混合物的1x匀浆缓冲液中。然后将细胞转移到离心管中并使用27G针悬浮。使用polytron均化器（速度4）在冰上均化样品1分钟。然后在4℃下以1,400 x g 超速离心样品10分钟。向沉淀中加入2ml含有cOmplete TM 蛋白酶抑制剂混合物的1x匀浆缓冲液。在冰上以4的速度再次使样品均化1分钟。将样品在1,400 x g 下超速离心10分钟，温度为4°C。将上清液和超速离心机在29,000 x g 下在4℃下混合40分钟。将颗粒储存在-80°C直至使用。
使用MEF微粒体的SCAM分析
1. 悬浮表达单个cys-突变体的微粒体在200μl的1x DPBS中用27G针头制备1mg / ml蛋白质溶液。
2. 对于正常的标记测定，跳过步骤C2并继续进行步骤C3。对于使用MTSES，MTSET或MTS-TEAE的竞争测定，向每个孔添加终浓度为2mM的竞争者。在光屏蔽条件下将细胞在冰上孵育30分钟。
3. 将50mM MTSEA-生物素稀释至微粒体溶液，终浓度为1mM。在光屏蔽条件下将微粒体在冰上孵育5分钟。
4. 在4,9℃下以12,900 x g 超离心5分钟。弃去上清液，向沉淀中加入200μl1xDPBS，并在相同条件下超速离心。
5. 向沉淀中加入500μl1％SDS / PBS。通过温和移液重悬沉淀，并在室温下旋转溶解30分钟。
6. 旋转后，使用SA珠子以与SCAM相同的方式使用完整细胞沉淀生物素化的蛋白质（参见方法A，步骤9-11）。通过免疫印迹分析洗脱的蛋白质。
使用MTS交联剂的交联实验
1. 悬浮在1x DPBS中表达双cys-突变体的微粒体，并用27G针进一步悬浮。可以根据Cys突变蛋白的表达水平调节1x DBPS的量。
2. 将溶解在DMSO中的8mM MTS交联剂加入微粒体溶液中，终浓度为0.2mM。将样品在37℃的铝块浴中孵育30分钟。
3. 将溶解在DMSO中的5M NEM加入到样品中，终浓度为10mM，以修饰不与交联剂反应的半胱氨酸残基。
4. 加入不含2-巯基乙醇的样品缓冲液，用涡旋轻轻混合样品，并通过免疫印迹分析。
使用铜 - 菲咯啉的交联实验
1. 制备微粒体作为步骤D1。
2. 将溶解在DMSO中的120mM CuSO 4和/或500mM菲咯啉分别加入到微粒体溶液中，终浓度分别为3mM和15mM。在室温下孵育样品2小时。
3. 如步骤D3和D4分析样品。

数据分析

通过免疫印迹获得的条带的强度通过ImageQuant LAS 4000可视化并通过ImageQuant TL分析。必须通过总蛋白质浓度标准化洗脱蛋白质的加载体积。 SCAM实验中获得的条带的一个例子如图1C所示。

图1.用于拓扑图谱的SCAM。 A.在完整细胞中，仅标记面向细胞外区域的半胱氨酸残基。 B.在微粒体组分中，标记面向细胞外和细胞外侧的半胱氨酸残基。 C.面向不同亲水环境的半胱氨酸的SCAM重复结果。 MTSEA-生物素的标记效率反映了目标残留物的水可及性。因此，带的较高强度表示水可及性较高（即，C4> C2> C1 = C3）。 D.C中4个半胱氨酸的代表性图像。虚线表示MTS试剂与指定残基（，，C1，C2和C3）的可接近性较低。 MTS试剂具有最弱的C1和C3（交叉符号）可访问性，而C2的可访问性更强，但仍弱于C4（三角符号）。
基于MTS的竞争者MTSES，MTSET和MTS-TEAE的大小不同，按照（从最大到最小）MTS-TEAE的顺序> MTSET＆gt; MTSES＆gt; MTSEA-生物素（Tominaga et al。，2016）。尺寸和离子电荷影响渗透到狭窄的亲水环境中（图2A）。因此，两种MTS试剂之间的标记竞争反映了目标半胱氨酸周围亲水环境的条件（图2B）。

图2.使用MTS试剂的竞争测定 A.竞争效率反映了半胱氨酸的水可及性。虚线表示试剂对半胱氨酸的可及性较小或不可及。如果半胱氨酸残基面向开放的亲水环境（C1和C3），则通过MTS试剂（，，MTSET或MTSES）的任一种预孵育来降低MTSEA-生物素的标记。然而，MTSET比CTSES（三角形符号）更难以接近C1，观察到不同的竞争效率。对于位于受限亲水环境（C2）中的半胱氨酸，两种MTS试剂都不能与目标半胱氨酸（交叉符号）反应。 B.面向不同亲水环境的半胱氨酸的标记和竞争结果的实例（[A]中的C1-C3）。
使用携带不同间隔臂的化合物的交联实验用于测量两种分离的蛋白质之间的空间距离（图3A）。通过对应于蛋白质异二聚体的条带的出现检测交联蛋白质，伴随着每种单体蛋白质的量的减少（图3B）。 8个MTS衍生的交联剂（M2M，M3M，M4M，M6M，M8M，M11M，M14M和M17M，间隔臂分别为5.2,6.5,7.8,10.4,13.0,16.9,20.8和24.7埃）是用于使用微粒体部分的交联实验（Loo和Clarke，2001）。铜和菲咯啉是氧化还原催化剂，氧化游离巯基并在碰撞的半胱氨酸中形成二硫键，可用于该方法（Klco et al。，2003）。

图3.交联实验。 A.不同多肽中的两个半胱氨酸与基于MTS的交联剂或铜和菲咯啉交联。 B.蛋白质A和B之间的交联实验结果。

笔记

在SCAM之前通过适当的方法检查目标蛋白的表达水平是非常重要的。
MTSEA-生物素应溶解在DMSO中，并在每次实验中分配前使用，以避免反复冻融循环。
如果SA珠子粘在样品上，可以测试以下附加程序：1）制备1％SDS / PBS溶解细胞并在每次使用前洗涤珠子，2）将样品超声处理以降低样品的粘度，3）在超声处理步骤中通过涡旋使样品均匀化，和4）减少样品的旋转时间（最少3小时）。
在交联蛋白质的分析中严格禁止还原剂，例如2-巯基乙醇或在高温下煮沸样品。
浓度为1mg / ml的蛋白质溶液是一个例子。可以根据靶蛋白的表达水平增加或减少蛋白质浓度。
该协议专为MEF细胞而设计。然而，其他细胞类型（例如，HEK 293细胞）已应用于SCAM以分析各种膜蛋白，例如多巴胺受体和乙酰胆碱受体。在这种情况下，必须优化包括蛋白质浓度，化合物孵育时间在内的实验条件。＆nbsp;
应在实验当天通过免疫印迹分析交联蛋白质。
对于条带的定量分析，化学发光试剂和曝光时间对于避免条带强度饱和至关重要。我们建议首先使用反应性较弱的试剂（例如，Immunostar），然后测试具有较高反应性的试剂（例如，Supersignal）。

食谱

1x PBS
8 mM Na 2 HPO 4 •12H 2 O
2 mM NaH 2 PO 4 •2H 2 O
蒸馏水中含131 mM NaCl
1x DPBS
6 mM NaCl
0.32 mM Na 2 HPO 4 •12H 2 O
108μMCCl
在蒸馏水中的60μMKH 2 PO 4
1x样品缓冲液
2％SDS
0.08M Tris-HCl（pH6.8）
10％甘油
0.2％亮绿色
0.2％CBB-G250在蒸馏水中
1x均质缓冲液
20mM HEPES-NaOH pH 7.0
140 mM KCl
0.25 M蔗糖
1 mM EGTA蒸馏水

致谢

我们感谢Drs。 Bart De Strooper（比利时KU Leuven）和Toshio Kitamura（日本东京大学）用于SCAM的有价值的试剂。我们要感谢Takeshi Iwatsubo博士对我们的SCAM研究的长期支持。这项工作部分得到了日本科学促进会的科学研究资助（A）（TT的第15H02492号授权）和青年科学家的研究奖学金（授予第18J14653号TC）（JSPS）。部分数据是根据Cai et al。（2017）的研究进行调整和修改的。

利益争夺

作者声明没有潜在的利益冲突。

参考

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