材料和试剂

500毫升真空过滤器（康宁，目录号：431097）
单刃剃须刀片（VWR，目录号：55411-050）
24孔组织培养板（VWR，目录号：10062-896）
显微镜盖玻片（VWR，目录号：16004-098）
Micro Slides，Superfrost Plus（VWR，目录号：48311-703）
注射器（胰岛素注射器）（BD，目录号：328468）
小鼠品系：雄性 mito-eYFP DAT-tTA 在4个月大时进行分析
1. mito-eYFP（C57BL / 6-Tg（tetO-COX8A / eYFP）1Ksn / J）（THE JACKSON LABORATORIES，目录号：006618）
2. DAT-tTA（B6; 129S-Slc6a3 tm4.1（tTA）Xz / J）（THE JACKSON LABORATORIES，目录号：027178）
超级胶水（Henkel，Loctite，目录号：1399967）
氯胺酮（盐酸氯胺酮，Hospira，目录号：02051-05）
甲苯噻嗪（AnaSed，NDC 59599-110-20）
试剂酒精（Sigma-Aldrich，目录号：793213）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：441244）
10x PBS（Merck，Calbiochem，目录号：6505-4L）
硬固定荧光灯安装介质（Vector Laboratories，目录号：H-1400）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8032）
1x PBS（见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）
0.02％（w / v）叠氮化钠（见食谱）

设备

灌注机（Gilson，型号：MINIPULS ® 3）
23 G Surshield安全翼式输液器（Terumo Medical，目录号：SV * S23BL）
钝剪（Thermo Fisher Scientific，目录号：78702）
锋利剪刀（Fisher Scientific，目录号：13-808-2）
镊子（Fisher Scientific，目录号：13-812-39）
金属刮刀（Fisher Scientific，目录号：14-374）
成人鼠标的亚克力脑矩阵，冠状切片，1 mm间距（World Precision Instruments，目录号：RBMA-200C）
Vibratome（Leica Biosystems，型号：Leica VT1000 S）
共聚焦显微镜（蔡司，激光扫描显微镜LSM 710 Observer Z1）

软件

Zen软件包（ZEN 2010B SP1，版本6,0,0,485，配置5.00.01）
FIJI（FIJI是Just ImageJ）（版本2.0.0-rc-67 / 1.52d）
注意：＆nbsp;
1. 这是ImageJ的分发包，带有用于图像分析的插件＆nbsp;
2. 可在此处免费下载（ https://imagej.net/Fiji /下载）
Microsoft ® Excel

程序

注意：所有动物程序均按照迈阿密大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。

产生 mito-eYFP DAT-tTA 小鼠
mito-eYFP DAT-tTA 小鼠是通过将携带多巴胺转运蛋白启动子驱动的四环素 - 反式激活因子的一个等位基因的小鼠与携带CMV-四环素反应元件的一个等位基因驱动线粒体靶向的eYFP的小鼠杂交而产生的。。我们根据Jackson实验室方案和引物序列对后代进行基因分型。在这项研究中，我们使用4个月大的男性，但我们没有预见到使用不同年龄和男性和女性的限制。小鼠连续喂食正常食物（无DOX）。因为DAT是由多巴胺能神经元特异性表达的蛋白质，所以小鼠仅在多巴胺能神经元的线粒体中表达eYFP（图1）。小鼠在4个月时处死。

图1.特异性地在多巴胺能神经元中表达mito-eYFP的育种策略。该系统涉及当从双转基因小鼠的饮食中去除四环素/强力霉素时诱导mito-eYFP表达。 />
心脏灌注和全脑固定（Gage et al。，2012）
1. 麻醉 Mito-eYFP DAT-tTA 小鼠，腹腔注射氯胺酮（90-120 mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10 mg / kg），从低剂量（90 mg / kg）开始混合氯胺酮和5mg / kg甲苯噻嗪）。如果小鼠在5分钟后仍然有反应，则增加剂量（通常直至120mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪）。检查小鼠不再表现出反射运动（用镊子夹住爪子和尾巴直到它对刺激没有反应）并将它们放在背上。在毛皮上喷洒70％乙醇，以防止其粘附在暴露的组织或工具上。
2. 使用钝剪刀，切开腹部，识别隔膜，捏住它直到肺部塌陷。切断横膈膜，肋骨暴露心脏。
3. 用镊子握住心脏，插入一根23 G针头，将冰冷的PBS灌注到左心室，用小而锋利的剪刀剪断右心房。 PBS灌注以7毫升/分钟的速度持续至少5分钟，直到肝脏从血液中看起来清澈。
4. 将灌注溶液切换到PBS中冰冷的4％PFA（每只小鼠20毫升或直到小鼠适当灌注并且身体大部分是刚性的）。
5. 用剪刀和镊子打开头骨，用金属刮刀小心地取出大脑。
6. Substantia nigra 位于中脑。为了分离含有 substanti a nigra 的中脑部分，将小鼠的大脑放在基质上并用两个单刃剃刀刀片，在Bregma 0 mm和Bregma -0.5 mm（冠状方向）切开大脑。将中脑切片在4％PFA的PBS中孵育过夜，温度为4°C。
脑切片准备
1. 将PFA固定的大脑（前囟0毫米）粘在振动切片机（Leica VT1000 S）的平板上，并将大脑浸入冰冷的PBS中。＆nbsp;
2. 切50微米厚的冠状脑切片。切片将漂浮在PBS中，因此使用小刷子可以捕获和收集切片。切片大约从前囟-2.46毫米到前囟-4.04毫米（总共约30片）。
  Leica VT1000 S vibratome的设置如下：
  1. 速度设定3
    注意：Leica VT1000 S vibratome上设置的最大速度为10。
  2. 频率设定7
    注意：Leica VT1000 S vibratome上设置的最大频率为10。
  注意：只要切片的厚度为50μm且大脑不经过冷冻过程，就可以使用任何切割技术（不同的振动切片，不同的嵌入技术）。
3. 每孔收集三个切片到含有PBS +叠氮化钠（0.02％w / v）的24孔板中。对于计数，每孔分析一个切片，每只小鼠总共10个切片。
4. 如果您选择在切片上进行免疫组织化学，可以在此阶段进行。否则，使用小刷子，小心地将切片放在载玻片上，在切片上放入20μl硬固定荧光安装介质，并用玻璃盖玻片覆盖切片。
  注意：
  1. 可以使用抗TH抗体对抗切片，以确认mito-eYFP DAT-tTA表达的特异性。
  2. 切片可以在4°C的PBS中保存，避免光线照射，但我们建议在分析前不要超过14天，因为EYFP荧光强度会随着时间的推移而降低。
脑片成像
1. 从10个安装的切片中，选择5，更清晰的染色（足够和可区分的神经突）。使用Zeiss激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss激光扫描显微镜，LSM 710，Observer Z1）和相关的ZEN软件包（ZEN 2010B SP1，版本6,0,0,485，配置5.00.01）从中脑获取Z-Stack图像区域放大20倍。＆nbsp;
2. 每个Z-Stack至少使用10个步骤。保存扩展名为“.lsm”的文件以进行图像分析。对所有Z-stack使用相同的设置（针孔，强度，对比度）。
3. 在我们的研究中，Zeiss LSM 710上用于图像采集的设置是：
  激光：氩气类型，激发480-515 nm，发射500-545 nm，功率5.00，增益700，数字偏移0.0，数字增益1.0
  图像尺寸：1024 x 1024像素
  针孔：89.9μm
  曝光时间：像素停留50.42微秒，扫描时间1分2秒
量化线粒体大小和神经突长度
使用FIJI软件包进行定量，图2-9显示免疫荧光图像中的逐步图像处理，从而定量线粒体大小和神经突长度。
1. 使用FIJI软件包打开.lsm文件。
2. 可选（如果已经使用额外通道进行免疫组织化学）。要分离通道并仅保留Mito-eYFP信息，请单击“图像”下拉菜单：颜色→分割通道→关闭除mito-eYFP通道以外的所有通道（图2）。
  
  图2. mito-eYFP通道的保留
3. 要展平Z-Stack并创建最大强度图像，请单击“图像”下拉菜单：堆栈→Z项目→最大强度（图3）。
  
  图3. Z-stack的最大投影
4. 要将图像转换为8位图像进行分析，请单击“图像”下拉菜单：键入→8位（图4）。
  注意：将图像转换为二进制而不是8位会产生太多背景。
  
  图4.转换为8位类型
5. 要反转图像的颜色，请单击“编辑”下拉菜单：反转（图5）。
  
  图5.反转通道颜色
6. 为了更好地将背景与实际图像分离以便观察完整的神经突但不会使像素强度过饱和，必须调整图像阈值。在8位灰度图像中，有256个（2 8 ）强度刻度，可以分配给像素。强度为0的像素为黑色，值为255的像素为白色，其间的所有像素均为灰色阴影。
  要设置图像分析的阈值，请单击“图像”下拉菜单：单击“调整”并转到“阈值”（图6中的步骤1）。在将出现的窗口中，直方图表示图像中像素强度的分布，从0（黑色）到255（白色）。将阈值设置为0到~240，图像中落在所选范围内的像素将以红色突出显示（图6中的步骤2）。如果对阈值的选择感到满意，请单击“应用”（图6中的步骤3）。
  注意：
  1. 在230到256之间将有属于背景的浅灰色和白色像素。阈值的设置将是图像特定的，但是在使用相同参数（针孔，对比度，强度）拍摄的图像之间，我们经历了最大5个强度刻度的差异。如果阈值设置得太高，红色像素将出现在背景中，在这种情况下，降低阈值，直到神经突和细胞体中的像素将以红色突出显示。
  2. 用于该方案的转基因小鼠已被广泛研究，并且先前已经评估了线粒体定位的特异性（Chandrasekaran等，2006）。因此，我们认为线粒体中位于神经突中的每个粒子具有> 1且<1的像素值。指示的阈值。
    
    图6.调整通道阈值以更好地查看轴突和神经突起
7. 要分析神经突中的线粒体，选择“手绘选择”并追踪要分析的神经突的整个长度。当追踪要分析的神经突时，该线不需要沿神经突“紧密”，但不得包括来自其他神经突的线粒体（图7）。
  
  图7.徒手选择追踪轴突/神经突进行分析
8. 要分析所选神经突中的线粒体，请单击“分析”下拉菜单：分析粒子→从“1到无穷大”设置→选中“显示结果”单击确定→将结果的前两列复制到Excel（图8）。
  注意：线粒体的典型大小非常依赖于所分析的细胞类型/区室。根据我们的显微镜设置和图像大小，线粒体的平均大小为4.1±0.8像素（1.95μm 2 ），与通常报道的相符跨物种（0.75至3μm 2 ）（Bereiter-Hahn等，1990; Wiemerslage和Lee，2016; Xu等。，2016）。
  
  图8.选定轴突/神经突中个体线粒体区域的分析
9. 要查找所选神经突的总长度，请单击“插件”下拉菜单：分段→简单神经突迹追踪→单击神经突开始→继续扩展神经突路径，如果是段，则单击是（y），或者no（n）如果段不正确（例如程序追踪的神经突不同于所选的神经突）→完成撤回神经突长度后，单击完成（f）→将神经突长度数据复制到Excel（图9）。 br />
  
  图9.选择的轴突/神经突长度的确定
10. 重复这些步骤，每张照片3-5个神经突，每只小鼠3-5张。

数据分析

在图10中，我们包含了一个带有所述计算的excel文件的示例：

每微米线粒体数量
划分每个神经突的线粒体数量（图8）并除以神经突长度（图9）。
示例：图10中的单元格G3是通过将B31中的值（粒子数）除以A2中的值（神经突长度）[= B31 / A2] 来计算的。
平均线粒体大小
平均获得每个线粒体区域的值（图8）。
示例：图10中的单元格G6是颗粒大小的平均值[=平均值（C2：C31）]
线粒体大小分布
1. 使用Excel排序功能，将线粒体大小数据从最小到最大排序（图10中的D列）。
2. 个别化属于不同区间的粒子（图10中的E列）并计算落入预定区间范围内的线粒体数（图10中的H9，H10和H11中的值）。
3. 将每个箱内的线粒体数量除以每只动物计算的线粒体总数，然后乘以100得到每个分箱组的百分比。
  示例：在图10中，通过将H9（箱＃1中的粒子数）除以B31（粒子总数）乘以100 [= H9 / B31 * 100]来计算单元格I9。对于bin＃2和bin＃3，单元格I10和I11中的值以相同的方式计算。
4. 使用堆积条形图，创建线粒体大小分布图。示例：在图10中，使用单元格I8，I11中的值创建图表

注意：

出于我们的目的，我们选择0-5μm，5-10μm，10-20μm和> 0的料箱尺寸。任意20μm。一旦线粒体大小数据从最小到最大排序，我们必须手动分离“分箱组”以生成线粒体大小分布图。＆nbsp;
使用单向ANOVA进行组间分析。每组应有n = 3只动物，每只动物分析9-25个个体神经突（每只动物3-5片，每片3-5片神经突）。
示例：在我们的研究中（Pinto等，2018），每组有n = 3只动物，每只动物分析9-19个个体神经突（每只动物3到5张照片，每个动物3到5个神经突）图片）。

图10.包含一个神经网络的数据分析的Excel文件的屏幕截图

食谱

PBS 1x
将100毫升10倍PBS加入900毫升MilliQ水中注意：PBS溶液不需要新鲜，可以在室温下储存长达24个月。
4％多聚甲醛（100毫升）
1. 在通风罩中的搅拌板上将80ml 1x PBS加入玻璃烧杯中
2. 在搅拌至约60℃的同时加热
3. 注意溶液不会达到70°C
4. 将4g多聚甲醛粉末加入到加热的PBS溶液中
5. 加入1-2滴1N NaOH
6. 该解决方案将在约20-30分钟内清除
7. 一旦多聚甲醛溶解，将溶液冷却并过滤
8. 用1x PBS将溶液的体积调节至100ml
9. 检查pH，用NaOH调节至7.4
备注：多聚甲醛毒性很大，在化学罩下称重。 4％多聚甲醛溶液可以在2-8°C的棕色瓶中储存长达两周。
0.02％（w / v）叠氮化钠
将0.2克溶于1升PBS 1x中备注：叠氮化钠毒性很大，在化学罩下称重。 0.02％叠氮化钠溶液不需要新鲜，可以在室温下保存。

致谢

这项工作部分得到了美国国立卫生研究院拨款1R01AG036871,1R01NS079965和5R01EY010804（CTM）以及帕金森病基金会奖学金PDF-FBS-1316（MP）的支持。我们感谢来自美国国立卫生研究院（NIH）的NEI中心拨款P30-EY014801的支持。作者没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

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Chandrasekaran，K.，Hazelton，J.L.，Wang，Y.，Fiskum，G。和Kristian，T。（2006）。小鼠中线粒体靶向荧光蛋白的神经元特异性条件表达。 J Neurosci 26（51）：13123-13127。
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