Materials and Reagents

Synechocystis PCC 6803
Glutamic acid [U-C14] (ARC 0165A, American Radiolabeled Chemicals) ([¹⁴C]Glu)
Methanol
25% ammonia solution

1 M NaCl
己烷
10％KOH
石油醚
氯仿
1 M Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4
X射线胶片（Eastman Kodak Company）
NH 4 OH
1 M TES [2 - [[1,3-二羟基-2-（羟甲基）丙-2-基]氨基]乙磺酸]/NaOH（pH8.2）
生长培养基BG11

设备

10ml顶空瓶（Sigma-Aldrich）
水浴摇床
2 ml O形圈帽管
玻璃珠（100-200μm）
涡流
台式离心机（MiniSpin plus，Eppendorf）
Speedvac集中器加（Eppendorf）
硅胶TLC板（SIL G-25，MACHEREY-NAGEL）
矩形TLC显影槽（Sigma-Aldrich）
Mikro 22R离心机（Hettich）
MiniSpin离心机（Eppendorf）

程序

标记需要在指数生长期的25ml蓝藻细胞培养物。方案对于在30℃下在生长培养基BG11中生长的蓝细菌集胞藻PCC 6803非常有效（Rippka ，1979），在750nm〜0.4的光密度。收获细胞通过在室温下使用制动器5（Mikro 22R离心机）在3500xg离心5分钟。
弃去上清液并将细胞沉淀重悬于补充有20mM TES（pH 8.2）的2ml生长培养基BG11中。将细胞转移到2ml管中，并在室温下在3500xg离心2分钟（MiniSpin离心机）。
弃去上清液并将细胞沉淀重悬在450μl生长培养基/20mM TES中。将细胞转移到玻璃小瓶。
孵育细胞在水浴摇动器30分钟，在100 rpm在光和温度条件下，你更喜欢你的实验。
加入溶解在生长培养基中的180μM的[14 C] Glu。在相同条件下再孵育30分钟。
将标记的培养物转移到2ml的O形环帽管。在室温下以7,000×g离心细胞2分钟，弃去上清液。在这一点上，细胞沉淀可以在液氮中冷冻并储存在-70℃或立即用于随后的颜料提取。
在室温下将细胞重悬于1ml H 2 O中，并将细胞以7000×g离心2分钟。弃去水，并用1ml H 2 O重复洗涤两次，以除去所有痕量的标记的[14 C] Glu。将细胞重悬于1ml甲醇/0.2%NH 4 OH中。加入50微升玻璃珠，涡旋1分钟，以促进颜料提取。在最大rpm下旋转4分钟。在昏暗的灯光下工作所有以下步骤
将上清液（〜1ml）转移到2ml管中，并向细胞中再加入300μl甲醇/0.2%NH 4 OH，涡旋并再次旋转。合并上清液并加入140μl的1M NaCl。
加入400μl己烷，涡旋并以最大转速旋转30秒以加速相分离。收集含有叶绿素的上层相。重复步骤9三次，并将所有己烷结合到2ml管中。
使用设置为V-AL的SpeedVac浓缩器和30℃蒸发己烷5分钟。
将沉淀重悬于190μl甲醇中，加入10μl10％KOH。在室温下孵育15分钟，将叶绿素转化为无叶绿素Mg-二氢卟酚。
用200μl己烷提取该溶液，弃去上层相，重复4次。
将剩余的〜150μl甲醇相转移到新的0.5ml管中。使用SpeedVac浓缩器蒸发此溶液，终体积为30-50μl。
用150μl石油醚萃取该溶液5次，弃去含有类胡萝卜素的上层相。
在30℃下完全蒸发30分钟，并将沉淀重悬在30μl甲醇：氯仿（1:1）中。加载10微升在TLC板上。 5μl可用于使用闪烁计数器测量（见下一步）。
加载10μl的颜料溶液在硅胶TLC板上。将板置于具有300ml流动相 - 甲醇：10mM Na H X H Y PO 4，pH 6.8的TLC显影槽中3：1，v/v）。在孵育30分钟后从培养皿中取出培养板，并在37℃下干燥10分钟。将板暴露于X射线胶片3-5天并显影。显影后，应检测到一个信号，对应于TLC上的Mg-氯化物"绿"带注意： >替代TLC，随后在X射线胶片上检测是使用闪烁计数器并直接测量最终颜料级分（5μl）中的放射性。后来的方法更快;然而由于 ¹⁴ C标记的杂质的存在，敏感度和准确度都会降低。

致谢

我们承认Algatech项目（CZ.1.05/2.1.00/03.0110）和捷克科学基金会项目的资金支持。 P506/12/1522。

参考文献

Koreny，L.，Sobotka，R.，Janouskovec，J.，Keeling，P.J.and Obornik，M。（2011）。四吡咯合成光合色素可能与apicomplexan寄生虫的不寻常途径同源。 Plant Cell 23（9）：3454-3462
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M。和Stanier，R.Y。（1979）。蓝藻的纯培养物的通用分配，菌株历史和特性。 J Gen Microbiol 111（1）：51-61。