材料和试剂

用于破碎细胞0.5mm的玻璃珠（Bio Spec Products，目录号：110/9105）
用乙醇制备的环己酰亚胺（CHX）（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）溶液100mg/ml。
Bradford反应性（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）。
可以使用不同类型的珠，这取决于特定的抗原基因蛋白和抗体。
1. 蛋白G磁性Dynabeads（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：100.04D）或Protein A磁性Dynabeads（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：100.02D）
2. 蛋白G Sepharose（Amersham biosciences，目录号：17-0618-01）或Protein A Sepharose（Amersham biosciences，目录号：17-0780-01）
磁体，在使用磁珠的情况下（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：123.21D）
抗体
例如，过氧化物 - 过氧化物酶可溶性复合物（PAP-抗体）购自Sigma-Aldrich（目录号：P1291）。针对HA（HA.11）（克隆16B12，目录号：MMS-101R）和Myc [c-myc（9E10），目录号：MMS-150R]的抗体购自Covance。
蛋白酶抑制剂混合物（F.Hoffmann-La Roche，目录号：13560400）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7625）在异丙醇上制备的100mM溶液
Laemmli样品缓冲液
蛋白质复合物的溶解缓冲液IP（参见配方）
核糖体IP的裂解缓冲液（参见配方）

设备

台离心机
玻璃珠打浆机Genie Disruptor（Scientific Industries，目录号：SI-DD38）

程序

初始相关复合物（NAC）和Ccr4-非复杂IP
1. 酵母培养物在YPD或选择性培养基上生长。在早晨稀释夜培养直至OD <600> = 0.15。在30℃下生长100ml培养物，直到OD 600 = 0.6-0.8。
2. 在4,000×g离心细胞5分钟。用1ml无菌H 2 O洗涤细胞并转移到eppendorf管中。细胞可以储存在-20°C
3. 在冰上工作！将沉淀重悬于0.5ml裂解缓冲液中，加入0.5ml玻璃珠，在4℃下在玻璃珠打浆机上破碎15分钟。
4. 将液相转移到新管中。用0.5ml裂解缓冲液洗涤珠子。合并所有液相。
5. 为了避免细胞污染德比预先清除总提取物。为了将液相转移到新管中。在4℃下离心1分钟16,000×g
6. 将上清液转移到新的eppendorf管中，并在4℃下离心20分钟16,000×g。
7. 测量上清液中的总蛋白浓度[= TE（总提取物）]。对于这种稀释，总提取物1:20，并加载5和10μl到Bradford样品（0.8ml水和0.2ml Bradford反应性）。
8. 使用蛋白A或蛋白G珠20μl的100％珠每个反应。用1ml水洗涤珠子20秒2次，用1ml裂解缓冲液洗涤1次，每次洗涤后，将珠子以800×g离心1分钟。在裂解缓冲液中重悬至20％。取每个反应100微升的这个悬浮液。
9. 将0.4ml含有2mg总蛋白（5mg/ml）的总提取物与100μl珠悬浮液和1-2μl抗体混合。
10. 孵育4小时，直到过夜，在4°C轻度旋转。
11. 用1ml裂解缓冲液洗涤珠子20秒，每次洗涤后将珠子以800×g离心1分钟。
12. 向珠子中加入50μlLaemmli样品缓冲液2x，并在65℃下孵育10分钟
13. 通过SDS-PAGE和western印迹分析CoIP。将总提取物（30μg）和免疫沉淀的部分（20μl）装载到凝胶上注意：对于控件，有2种可能性。
  1. 使用缺乏免疫沉淀抗原的菌株的总提取物。
  2. 使用与IP相同的总摘录，但不添加抗体。
核糖体IP
在相同的mRNA上形成多核糖体。可以免疫沉淀分开的核糖体颗粒（40S或60S）或多核糖体。为了破坏多核糖体，将25mM EDTA加入到缓冲液中。为了保持多核糖体，在收集之前向培养物中加入0.1mg/ml的放线菌酮（CHX）并加入到所有溶液中。
1. 酵母培养物在YPD或选择性培养基上生长。在早晨稀释夜培养直至OD <600> = 0.15。在30℃下生长100ml培养物，直到OD 600 = 0.6-0.8。
2. 保持多核糖体添加放线菌酮（CHX）直至最终浓度为0.1mg/ml，并在冰上孵育10分钟。破坏多核糖体避免这一步。
3. 保持多核糖体以4,000×g离心细胞5分钟，并用50ml含有0.1mg/ml CHX的冷水洗涤。为了破坏多核糖体用50ml冷水洗涤，不用CHX。
4. 将沉淀重悬在1ml含有0.1mg/ml CHX（在多核糖体的情况下）的裂解缓冲液中，旋转。可以将细胞冷冻并储存在-20℃。
5. 将液相转移到新管中。用0.5ml裂解缓冲液洗涤珠子。合并所有液相。
6. 为了避免细胞污染德比预先清除总提取物。为了将液相转移到新管中。在4℃下离心1分钟16,000×g。
7. 将上清液转移到新的eppendorf管中，并在4℃下离心20分钟16,000×g 。
8. 测量上清液中的总蛋白浓度[= TE（总提取物）]。对于这种稀释，总提取物1:20，并加载5和10μl到Bradford样品（0.8ml水和0.2ml Bradford反应性）。
9. 使用蛋白A或蛋白G珠20μl的100％珠每个反应。用1ml水洗涤珠子20秒2次，用1ml裂解缓冲液洗涤1次，每次洗涤后将珠子在800× g 1分钟。每次反应取100μl此悬浮液。
10. 将0.4ml含有2mg总蛋白（5mg/ml）的总提取物与100μl珠悬浮液和1-2μl抗体混合。
11. 在4°C下孵育2-4小时，轻微旋转
12. 用1ml含有0.5％Triton X-100的裂解缓冲液洗涤珠子20秒，3次。每次洗涤后，将珠子以800×g离心1分钟
13. 向珠子中加入50μlLaemmli样品缓冲液2x，并在65℃下孵育10分钟
14. 通过SDS-PAGE和western印迹分析CoIP。将总提取物（30μg）和免疫沉淀的部分（20μl）装载到凝胶上注意：对于控件有2种可能性。
  1. 使用缺乏免疫沉淀抗原的菌株的总提取物。
  2. 使用与IP相同的总摘录，但不添加抗体

食谱

用于蛋白质复合物（例如NAC或Ccr4-Not复合物）的溶解缓冲液IP（Panasenko等人，2009; Panasenko和Collort，2011）
通常我们使用2种类型的缓冲区。在它们两者中，蛋白质复合物可以有效地免疫沉淀裂解缓冲液1（Panasenko et al。，2009）
40mM HEPES-KOH（pH7.5） 100 mM KCl
150 mM K-acetate
1mM EDTA（pH8.0） 20％甘油裂解缓冲液2（Panasenko和Collort，2011）
50mM Tris-HCl（pH8.0）
100 mM NaCl
1mM EDTA
5mM MgCl 2/
1 mM DTT
10％甘油 0.5 mM PMSF
核糖体IP的裂解缓冲液（Panasenko和Collort，2012）
10mM Tris-HCl（pH7.5） 100 mM NaCl
30mM MgCl 2/v/v 0.1％Triton X-100 1mM PMSF
注意：在多核糖体破坏的情况下，所有溶液含有0.1mg/ml的CHX，以防多核糖体或25mM的EDTA。

致谢

这项工作得到Ernst和Lucie Schmidheiny基金会和Pierre Mercier基金会授予O.O.P.的资助。并授予瑞士国家科学基金会的31003A-120419和31003A_135794以及授予M.A.C.的诺华基金会赠款。

参考文献

Panasenko，O.O.和Collart，M.A。（2011）。 Not4 E3连接酶通过Ecm29部分有助于蛋白酶体装配和功能完整性。 Mol Cell Biol 31（8）：1610-1623。
Panasenko，O.O.和Collart，M.A。（2012）。 Not5和泛素化Rps7A在多核糖体级分中的存在取决于Not4 E3连接酶。 em> Mol Microbiol 83（3）：640-653。
Panasenko，O.O.，David，F.P.and Collart，M.A。（2009）。新生多肽相关复合物的核糖体结合和稳定性取决于其自身的泛素化。 181（2）：447-460