材料和试剂

个人防护用品 - 头发网，手套
4-0黑丝线（Kent Scientific，目录号：INS701073）
9毫米伤口夹（BD，目录号：427631）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
胰岛素注射器（BD，目录号：329412）
碘片（PDI Healthcare，目录号：S41350）
（可选）啮齿动物面膜隔膜（Smiths Medical，Surgivet，目录号：32247B1）
无菌外科覆盖物
500 ml过滤系统
受精的一个细胞Sprague Dawley胚胎（见注释）
8周龄女性Sprague Dawley受体大鼠
Vasectomized Sprague Dawley雄性大鼠
促黄体激素释放激素激动剂（LHRHa）（Sigma-Aldrich，目录号：L4513）
70％乙醇
丁丙诺啡（Southern Anesthesia＆amp; Surgical，目录号：12496075705）
Carprofen（Zoeis Services，目录号：060062）
氨苄青霉素（Fisher Scientific，目录号：BP1760-25）
0.1％肾上腺素（Acros Organics，目录号：204400010）
无菌，非药物眼用软膏（Rugby Laboratories，目录号：301905）
胚胎测试水（Sigma-Aldrich，目录号：W1503）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：158968）
青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P7794）
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S1277）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P4562）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：03609）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G8540）
乳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L7900）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
苯酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P0290）
异氟烷（AMERISOURCE BERGEN，目录号：10103618）
LHRHa溶液（参见食谱）
KSOM培养基（见食谱）（Cold Spring Harbor，2006）

设备

生物安全柜
pH计
口吸管（Fisher Scientific，目录号：NC9048719）
制造商：BIOTECH，型号：MP001Y。
玻璃移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-20C）
火焰源拉吸液管
个人防护装备 - 清洁实验室外套
9毫米伤口夹具（BD，目录号：427630）
显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica S8 APO）
精镊子（精细科学工具，目录号：11251-10）
弹簧剪刀（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-5650）
大型剪刀（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-5910）
手镊（Roboz手术器械，目录号：RS-8100）
微型夹（Roboz Surgical Instrument，目录号：RS-5420）
Versi-Dry表面保护膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：74000-00）
37℃加热板（C＆amp; A Scientific，Premiere，目录号：XH-2002）
动物剪刀（Oster，目录号：078005-301-003）
珠粒灭菌器（CellPoint Scientific，目录号：5-1450）
麻醉机（Smiths Medical，Surgivet，catalog number：WWV9000）
啮齿动物麻醉电路组（Smiths Medical，Surgivet，目录号：V7103）
大橡皮筋

程序

手术前五天上午11:00至下午1:00，将0.2ml200μg/ ml LHRHa溶液（见食谱）注射到雌性受体大鼠的腹腔内，以同步发情。
手术前一天中午，雌性受体大鼠与输精管切除的男性配对。
检查第二天早上女性是否存在阴道交配插塞作为交配证据。在手术中使用阴道插头女性，将阴性女性放回殖民地两周，然后重新使用。
外科医生应穿干净的实验衣，头发网和手套。通过用70％乙醇擦拭显微镜的底部并放置干净的表面保护剂来制备消毒区域。转移的胚胎如前所述（Filipiak和Saunders，2006）生产和收集，并在转移前至少24小时在37℃下在KSOM（见食谱）中孵育。
仪器在第一次手术前进行高压灭菌，并在多达四次额外的手术中进行灭菌。在手术之间，用无菌生理盐水擦拭仪器，然后将每个仪器的尖端插入250°C珠粒灭菌器15秒。在使用前，请勿在无菌Kimwipe上冷却至少1分钟。
通常在接种大鼠的3-5分钟内诱导麻醉，在室内以1.0-1.5升/分钟（L / min）的5％异氟醚与氧气作为载气。通过将预先麻醉的大鼠的鼻子放置在鼻锥中，通过3％异氟烷在手术期间维持麻醉（图1）。可以使用手套和橡皮筋创建膈肌，并切割一个小孔，紧贴麻醉大鼠的鼻子（见注释）。

图1.通过紧配合鼻锥接受异氟烷麻醉的大鼠
通过将薄薄的一层软膏压在眼睛上，直接触摸眼睛而不污染管，将眼药膏涂抹在眼睛上。
皮下注射丁丙诺啡（0.05mg / kg），卡洛芬（5mg / kg）和0.5ml氨苄青霉素（100mg / ml）也在手术之前立即进行。
首先通过观察呼吸频率降低，然后重复不再出现尾部或脚部反射来确保手术深度的麻醉。
将受体大鼠的下背部剃光在左子宫角上方，并放置在显微镜台上的无菌组织上。
剃光区域用碘吸印并用70％乙醇浸泡的组织擦拭以制备手术区域并除去由剃刮引起的多余的毛发颗粒（图2）。这是重复两次。

图2.剃须和灭菌后大鼠完全准备手术。黑线所示的切口位置。
无菌悬垂布置在动物身上。
在背部至腹侧方向上长约1厘米的单个切口在皮肤上使用夹钳和大剪刀在最后一个肋的水平（图3）进行。

图3.初始切口皮肤和皮下脂肪 D：背部; V：腹侧SC：皮下脂肪; BW：体壁。
使用精细的镊子取出体壁，用左侧卵巢脂肪垫上的弹簧剪刀（避开血管）制成小切口（图4）。

图4.通过体壁切口。 D：背侧; V：腹侧BW：体壁; OFP：卵巢脂肪垫。
用精细的镊子抓住卵巢脂肪垫，并将生殖道的远端部分从腹腔轻轻地收回。通过附着的微型夹子将脂肪垫保持在适当的位置，在子宫下方有一个紧密卷绕的组织的无菌片（图5）。

图5.外部卵巢和脂肪垫。 D：背侧; V：腹侧OFP：卵巢脂肪垫; OB：卵巢囊OV：输卵管U：子宫。
用精细的镊子手动撕裂卵巢囊的最小血管化区域，提供通向输卵管口的途径（图6）。

图6.卵巢囊的最小血管化面积的位置。D：背侧; V：腹侧OFP：卵巢脂肪垫; OB：卵巢囊OV：输卵管U：子宫。
将1-2滴肾上腺素（约20μl）从注射器滴到粘液囊上，直到出血停止。这减少了手术的长度，并加快了口位置。
转移口吸管的尖端装载有15-20个胚胎用于植入，并且在用细镊子稳定之后插入输卵管的口中。通过移液管通过轻轻的压力将胚胎注入输卵管（图7）

图7.胚胎进入生殖道的位置。D：背部; V：腹侧OFP：卵巢脂肪垫; OB：卵巢囊OV：输卵管U：子宫O：口。
腹部仔细更换生殖道，并通过身体壁上的2条缝线闭合腹部（图8），然后用2个伤口夹将皮肤闭合。

图8.缝线在腹壁中的位置。 D：背部V：腹侧SC：皮下脂肪; BW：体壁。
手术后，将恢复的大鼠置于置于37°C加温板上的大鼠笼内，直到动物完全清醒和垂直，通常为5至10分钟（见注释）。
将笼子返回到大鼠室中的笼架，并在24小时后皮下注射0.2ml卡洛芬（5mg / ml）作为手术后镇痛。最多可以将三名女性安置在一起。
每天监测大鼠，以验证该程序的恢复。女性在手术后20天分开，以分娩出笼。

数据分析

使用输卵管转移手术详细描述转基因大鼠的研究报告可在线获取（Lambert等人，2016）。

笔记

普通的黑曲霉菌株包括Sprague Dawley，Wistar，Dahl SS和F344。胚胎没有性别决定是必要的。 Taconic和Charles River是推荐的供应商。
双细胞胚胎也可以通过这种方法转移
5至25个胚胎可以转移到每个女性。
如果切口大于1厘米，可以使用另外的缝线和/或伤口夹
与老鼠相比，大鼠的脂肪过多。小心处理脂肪垫而不刺穿或撕裂纸巾。
也可以在有或没有开口的情况下购买隔膜，并切割成所需的尺寸（Surgivet）。
手术失败的症状包括呼吸频率低下，呼吸困难和/或喘气和嗜睡。

食谱

LHRHa解决方案
将1mg的LHRHa粉末溶解在5ml无菌水中200μg/ ml的储备液在-20°C储存1 ml等分试样
KSOM（Cold Spring Harbor，2006）
500毫升胚胎测试水
2.775克NaCl 0.095克KCl
0.025g KH 2 PO 4
0.025g MgSO 4·7H 2 O→/ / 0.02 g葡萄糖 0.03克青霉素
0.025g链霉素
1.05g NaHCO 3
0.01克丙酮酸钠
0.002g EDTA
0.073g L-谷氨酰胺
0.935克乳酸钠
0.125g CaCl 2·2H 2 O ○
0.5克牛血清白蛋白 50微升酚红
将试剂在175 ml胚胎试验水中合并。调节体积至500 ml。使用500 ml过滤系统，将溶液过滤到生物安全柜中。检查pH值并将剩余溶液储存在4°C。孵育后检查pH（pH值应该下降）;理想pH值为7.1-7.7

致谢

阿拉巴马大学伯明翰大学Transgenic＆amp;遗传工程模型设施（RAK）由美国国立卫生研究院支持[授权号P30 CA13148，P30 AR048311，P30 DK074038，P30 DK05336和P60 DK079626]和UAB囊性纤维化研究中心。所有程序均经IACUC和UAB动物资源计划（ARP）批准进行，并符合实验动物和啮齿类动物生存手术的护理和使用指南（Bernal等人， 2009; Albus，2012; Cunliff-Beamer，1993; Waynforth，1992）。我们承认作为适应基准的菲律宾和桑德斯的工作。

参考

Albus，U.（2012）。护理和使用实验动物（8 th 版）。实验动物 46（3）：267-268。
Bernal，J.，Baldwin，M.，Gleason，T.，Kuhlman，S.，Moore，G.and Talcott，M。（2009）。啮齿动物生存手术指南。投资手册 22（6）：445-451。

冷泉港。 KSOM。（2006）。冷泉Harb Protoc 。

Cunliff-Beamer，TL（1993）。应用无菌手术的原则到啮齿动物。 AWIC通讯 4（2）：3-6。

Filipiak，WE and Saunders，TL（2006）。 Advances转基因大鼠生产中。转基因 Res 15（6）：673-686。

Hankenson，FC（2013）。实验室小鼠和老鼠的重要护理管理 CRC Press 。

Krinke，GJ，Bullock，GR和Bunton，T。（2000）。实验室大鼠。 Elsevier Science 。

Lambert，LJ，Challa，AK，Niu，A.，Zhou，L.，Tucholski，J.，Johnson，MS，Nagy，TR，Eberhardt，AW，Estep，PN，Kesterson，RA and Grams，JM（2016）。增加骨小梁骨和改善生物力学在骨钙素无效大鼠由CRISPR / Cas9技术创建的模型。 Dis Model Mech 9（10）：1169-1179。

Smith，JC，Corbin，TJ，McCabe，JG和Bolon，B。（2004）。异氟烷与吗啡是转基因大鼠生产中胚胎移植的合适麻醉方案。实验动物 38（1）：38-43。 />

Waller，SJ，Ho，MY and Murphy，D。（1995）。通过在受精的单细胞卵中显微注射克隆的DNA来生产转基因啮齿类动物在：Glover，DM和Hames，BD（Eds）。 DNA克隆卷。牛津大学出版社 pp：184-229。

Waynforth，HB和Flecknell，PA（1992）。大鼠实验和手术技术。第二版学术出版社。