移液器（例如，，Sartorius，目录号：728020,728050,728060和728070）
微生物孵化器振荡器（例如，IKA，型号：KS 4000 i对照）
用于1.5ml管的台式离心机（例如，Eppendorf，型号：5424）
罗氏MagNA Lyser仪器（瑞士巴塞尔）
Thermomixer舒适（Eppendorf，汉堡，德国）
Epoch微孔板分光光度计（Biotek，Winooski，VT，USA）
Biosan DNA / RNA UV清洁盒（Warren，MI，USA）（推荐见附注4）
热循环仪（例如Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，型号：GeneAmp PCR System 2700）（Paisley，UK）
具有TX-750转子的Heraeus Megafuge 40R（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Megafuge TM 40R，目录号： 75004518; TX-750转子：Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：75003180）和板用插入件（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号： 75003617）和Falcon管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：75003608）
幻灯片湿度保存盒（例如， LabScientific，目录号：HIC-3）
GeneMachines Omnigrid 100接触阵列器（美国威斯康星州麦迪逊）
国际微阵列针隐形3 SMP3（Telechem，目录号：SMP3）
Agilent SureScan DNA微阵列扫描仪（Santa Clara，CA，USA）
高压灭菌器
Sartorius arium pro UV超纯水系统（Sartorius，型号：arium ® pro）

软件

GenePix Pro 6.0软件（Molecular Devices LLC，Sunnyvale，CA，USA）
Microsoft Excel或任何其他数据分析软件
用于微阵列探针设计的ARB软件包（注3）
Primer3用于底漆设计（注3）

程序

寡核苷酸的制备
1. 将5'氨基修饰的微阵列探针在不含核酸酶的水中溶解至100μM
2. 将33-plex PCR引物溶解于不含核酸酶的水中的100μM，然后通过将等体积的所有66个引物（例如，每个6μl）移液到一个1.5ml Eppendorf中来产生100μM引物混合物管。
3. 挂锁探针的溶解和磷酸化（注8）。
  1. 在无核酸酶的水中将挂锁探针溶解至200μM，然后通过吸取1体积的挂锁探针（例如，66×10.00μl）和0.34体积的核酸酶 - 游离水（例如，总共66×10.00×0.515 =340.00μl）放入1.5ml Eppendorf管中。
  2. 挂锁探针的磷酸化主混合物通过将10μlT4多核苷酸激酶（0.2U /μl最终浓度），50μl10x反应缓冲液A（1x最终浓度），50μl10mM ATP（1mM最终浓度），250μl挂锁探针混合物（每个探针最终浓度1μM）和140μlPCR级水（终体积500μl）。
  3. 在37℃下孵育30分钟，然后在65℃孵育10分钟。
4. 存储微阵列探针，挂锁探针，底漆和相应的主混合物在-20°C
细菌细胞的生长和基因组DNA提取物的制备（注5）
1. 接种来自甘油储备液的纯培养物（例如，/或从琼脂培养物）或临床分离物（例如，从琼脂培养物）将5 ml CASO培养基（见食谱）放入15 ml Falcon管中（注6）。不要完全拧上盖子，以适当通风细菌。
2. 在37℃下，以300rpm在轨道振荡培养箱中孵育14-18小时的样品（注7）。
3. 旋转Falcon管，并将2ml培养物转移到2ml Eppendorf管中
4. 通过在室温下以2,400×g离心5分钟使细菌颗粒化
5. 将沉淀重悬于1ml 1x PBS中（参见食谱）
6. 在室温下以2,400×g离心悬浮液5分钟。
7. 将沉淀重悬于1ml无菌ddH 2 O中，并转移到适合MagNA Lyser的2ml螺旋盖管中。
8. 将150-212μm的酸洗珠子和等体积的直径为425-600μm的酸洗珠子与管接合，使得珠粒占管的约三分之一。
9. 使用MagNA Lyser在室温下以6,500 rpm破坏细菌和真菌细胞30秒。
10. 在室温下放置样品5分钟。
11. 重复步骤A9一次。
12. 对于热裂解，在95℃在温热混合器中孵育样品20分钟。
13. 以最大速度离心10分钟。
14. 将上清液转移到新管中
微阵列处理
1. 通过向每个孔中加入18μl的2x点样缓冲液（参见食谱）来制备Ritter 384孔斑点板，然后向每个孔中加入18μl微阵列寡核苷酸（每个寡核苷酸的终浓度现在为50μM） 1x点样缓冲液）。注意哪些寡核苷酸在哪个孔中以及您的识别剂如何将寡核苷酸转移到载玻片上（注4）
2. 将Omnigrid接触排列器设置为60％的空气湿度，并设置机器以每张幻灯片4次重复打印寡核苷酸（注9和10）。
3. 使用产生直径为100μm的斑点的SMP3引脚将寡核苷酸定位在具有醛表面的载玻片上
4. 点样后，让寡核苷酸附着大约潮湿气氛中5小时。
5. 发现后，玻璃片不会洗涤。
6. 在室温下存放载玻片。
物种识别
1. 16S rRNA基因PCR
  1. 根据表1，使用Molzym Mastermix 16S Basic试剂盒，在0.2ml PCR管中准备PCR主混合物进行n + 1反应，包括至少一个阴性对照（NTC），您可以用水替代基因组DNA提取物。可以预先制备由等量的所有四种引物在15μM组成的引物混合物，以避免重复移液。在这种情况下，使用1.20μl的底漆混合物。保持样品在冰上冷冻，直到放入热循环仪（注11）
    表1.用于16S rRNA基因鉴定的多重PCR主混合物
  2. 在具有加热盖的热循环仪中使用表2中列出的PCR程序（图2），使用“33-复合体预扩增PCR进行β-内酰胺酶编码基因鉴定”进行该反应（图2）。
  3. PCR运行结束后，将样品保持在4°C
    表2.用于16S rRNA基因鉴定和β-内酰胺酶编码基因信息的预扩增的多重PCR程序
    
    图2.测定检测原理的示意图对于物种鉴定，使用通用16S引物（A1）扩增16S rRNA基因。随后，使用线性PCR和Cy5修饰的胞嘧啶（A2）标记PCR产物。同时，β-内酰胺酶基因在33plex PCR（B1）中预扩增。然后，使用β-内酰胺酶PCR产物作为模板，将挂锁探针杂交（B2）并连接（B3），并在第一滚环扩增（RCA）（B4）中扩增。 RCA产品包含C2CA序列和相应的16S rRNA条形码序列。在下一个反应中，使用限制酶和环化（B6）将RCA产物单体化（B5）作为第二个RCA（B7）的新模板。这些C2CA产物在使用Atto532修饰的胞嘧啶（B8）的线性PCR反应中进行标记。最后，将来自16S rRNA基因PCR和多重挂锁测定的标记的扩增产物汇集在一起并与两个不同荧光波长（C）检测产物的微阵列杂交。
2. 用于PCR产物标记的线性PCR
  1. 根据表3，用0.2ml PCR管制备线性PCR主混合物，用n + 1反应制备来自先前PCR的PCR产物。保持样品冷却至放置在热循环仪中。
    
    表3.用于PCR产物标记的线性PCR主混合物
  2. 使用表4中概述的PCR程序在具有加热盖的热循环仪中，使用“线性PCR”中的C2CA产物标记进行该反应。
    
    表4. PCR和C2CA产品标记的线性PCR程序
多重β-内酰胺酶编码基因鉴定
1. 用于β-内酰胺酶编码基因鉴定的33倍预扩增PCR
  1. 根据表5，使用Molzym Mastermix 16S Basic试剂盒，在0.2ml PCR管中准备PCR主混合物进行n + 1反应，包括至少一个NTC。引物浓度各自为76nM。将样品冷却至放置在热循环仪中（注11）
    表5：β-内酰胺酶编码基因鉴定的多重预扩增PCR
  2. 按照表2所述运行PCR程序。
2. 通过挂锁探针进行杂交和环化
  1. 根据表6，为n + 1个样品准备连接混合物（每个样品10μl）
    表6.通过酶连接挂锁探针进行环化的酶反应混合物。 66 nM的挂锁主混合浓度等于每个探针1 nM。
  2. 从33plex PCR中将10μl连接混合物加入到PCR产物中。每个挂锁探头的最终浓度分别为100 pM
  3. 在95℃下孵育5分钟，然后在加热盖子的热循环仪中在60℃孵育1小时。
3. 第一滚圈放大
  1. 使用上述反应的连接产物，对于n + 1反应，制备如表7所述的第一次滚环扩增（RCA）的反应主混合物。
    
    表7.第一个RCA的反应混合
  2. 在37°C孵育20分钟。
  3. 在65℃下孵育2分钟使聚合酶失活。
4. C2CA寡核苷酸的杂交和酶促限制的单体化
  1. 如表8所述，为n + 1反应制备限制性混合物。
    
    表8.酶限制反应的反应混合物
  2. 将5μl限制性混合物加入到第一个RCA混合物中（总体积现在为25μl）
  3. 在37℃孵育5分钟。
  4. 在65℃孵育5分钟以灭活限制酶。
5. 循环，结扎和第二次RCA
  1. 使用上述反应的产物，准备连接和第二个RCA主混合物，如表9所述，用于n + 1反应。
    
    表9.循环，结扎和第二RCA
  2. 将10μl的主混合物加入上一反应。
  3. 在37°C孵育20分钟。
  4. 在65°C温育2分钟，灭活连接和RCA反应
6. 在线性PCR中标记C2CA产物
微阵列分析
1. 通过将15μl标记的PCR产物，15μl标记的C2CA产物，1μlCy5标记的“杂交对照”寡核苷酸以50μM的浓度和30μlExpressHyb杂交溶液合并，为每个样品准备检测组合。
2. 用提升器滑盖覆盖微阵列滑块（幻灯片在使用前未洗涤）。
3. 移动整个检测组合在升降机下。
4. 将幻灯片置于潮湿的孵育室中（注12）
5. 在65℃孵育45分钟。
6. 取下升降单。
7. 在2×SSC + 0.1％SDS中将载玻片在载玻片上或染色瓶中搅拌5分钟
8. 在载玻片上或0.2×SSC中洗涤玻片2分钟，同时搅拌
9. 在玻璃架或染色瓶中，在H 2 O 2中洗涤玻片1分钟，同时搅拌。
10. 通过离心（2分钟，175×g / 900rpm）干燥载玻片（注13）。
11. 使用正确的参数检测Cy5和Atto532荧光团，在微阵列扫描仪中扫描载玻片。

数据分析

将两个荧光通道的图像导入GenePix Pro 6.0。
创建一个.gal文件，覆盖一个数组，其中包含您所发现的微阵列探针的位置和名称。
使用“分析”功能，计算各个斑点的平均值和中值强度以及标准偏差（以及更多值）。
将结果导出为文本文件，并将其导入Microsoft Excel或适用于数据分析的任何其他软件（例如，，GraphPad Prism，R，IBM SPSS或其他电子表格软件）。

笔记

我们使用Sartorius arium pro UV超纯水系统。缺乏中空纤维超滤器导致内毒素，微生物，DNA酶和核糖核酸酶的不完全去除，导致不是PCR级的水。
请考虑大多数酶试剂盒不含DNA。从细胞培养物中表达和纯化酶如聚合酶。通常使用抗生素抗性基因作为选择标记，并且这些和其他基因的污染可能残留在纯化的酶中。专业工具包优化了纯化程序，以消除这些DNA污染
微阵列探针和引物设计：使用ARB软件包的“探针设计”功能设计5'-氨基修饰的微阵列探针。总之，从GenBank下载rRNA序列并导入ARB。生成的探针针对最大非组命中，熔解温度，G + C含量和最小发夹环进行了优化。使用ARB的“Oligo”功能评估熔融温度和二级结构。最后，通过添加或去除关于双链体形成和熔融温度的核苷酸手动优化探针。使用ARB的“探针匹配”功能检测寡核苷酸的特异性。使用Primer3设计靶向33个β-内酰胺酶基因的多重PCR引物。当设计多重PCR引物时，重要的是避免引物二聚体形成，并且引物熔解温度差异较小（这里：55°C）。
虽然不是必需的，但我们强烈建议在无DNA / RNA的环境中制备寡核苷酸稀释液和主混合物用于PCR，以避免交叉污染。将基因组材料（包括PCR产物）加入PCR罩外进行酶促反应。通过紫外线照射在不同的步骤之间灭菌紫外线罩
使用基于珠的细胞破坏方案的基因组DNA提取物的制备具有可以同时提取革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的基因组材料的优点，而大多数市售试剂盒对于这两种类型需要不同的方案。 >
可能需要向培养基中加入抗生素，因为在液体细胞培养物中不存在抗生素时，由于细菌的适应性和竞争性降低，细菌往往会失去其抗生素抗性基因和质粒。
细菌或真菌生长由多云雾霾指示。细菌应在指数期结束时最佳收获（OD 600）约2）。
需要使用挂锁探针5'-末端的磷酸化，以便在连接反应中连接3'-与5'末端。我们建议订购挂锁探针直接在5'端磷酸化。然而，如果寡核苷酸的修改被命令，则寡核苷酸的成本显着增加
在低湿度下发现，斑点干燥得太快，导致圆环形斑点。如果湿度过高，斑点变大，可能会渗透到相互之间，造成不均匀的异质斑点
甲硅烷基化的醛载玻片被清洁，并且在发现之前不需要清洁载玻片。然而，在将玻璃滑入夹具之后，我们建议用高压空气手枪吹掉玻璃碎片。
在我们的例子中，1μl的基因组DNA提取物对应于11-48ngμl -1 的浓度。
处理底部有水的孵化室时要小心。为了避免溢出水，将毛巾放在底部，这仍然释放湿度。
使用我们的离心机（Heraeus 40R）和摆动叶轮转子，900 rpm等于175 x g。不要以更高的速度旋转幻灯片，以防止损坏幻灯片或离心机。

食谱

CASO媒体
重量30克胰蛋白胨大豆肉汤，溶于1升水中在121℃高压灭菌15分钟。储存于4°C
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
稀释100毫升10倍的PBS在850毫升的水中使用HCl或NaOH将pH调节至7.2，并将最终体积调整至1L
在室温下存放
2x斑点缓冲液（6x SSC，3M甜菜碱）
将20.27g甜菜碱一水合物溶于15ml 20x SSC缓冲液中用水调节体积至50ml 用0.20微米注射器过滤器对溶液进行无菌过滤，并转移到新的50ml管中在室温下存放

致谢

该方案已经从Barišić等人（2016），Journal of medical microbiology，65（1），pp。48-55中改编。

参考

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