材料和试剂

移液器提示（ https://online-shop.eppendorf.com ）< br />
板（60毫米）
离心管，1.5 ml（Eppendorf，目录号：022364111）
吸收纸（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：0131）
96孔板，盖子（Corning，Costar ®，目录号：3599）
密封胶带用于96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：15036）
线虫（野生型N2）
注意：这些线虫根据每个研究者的实验进行处理。在本协议中，线虫数量不同。
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：23225或23227）

蛋白质标准（5 mg / ml）
BCA试剂A和B

SOD测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，目录号：S0101）

反应引发溶液
SOD检测缓冲区
WST-8
酶溶液
反应引发溶液（40x）

CAT测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，目录号：S0051）

酶结合物
洗液40x
基板A和B
停止解决方案

水合钠（NaOH），分析试剂（国药化学试剂，目录号：10019762）
次氯酸钠（Antiformin，NaOCl，6-14％活性Cl），分析试剂（ALADDIN，目录号：S101636-500 ml）
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4），分析试剂（国药化学试剂，目录号：20032118）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4），分析试剂（国药化学试剂，目录号：10017618）
Clorox溶液（参见食谱）
磷酸缓冲盐水/缓冲液（PBS），pH 7.0（参见食谱）

设备

移液器
显微镜
离心机，Eppendorf 5417R（Eppendorf，型号：5417 R，目录号：01396）
Pestles，Eppendorf（Eppendorf，目录号：F0140010）
电机驱动式粉碎机（北京百湾电子科技有限公司，目录号：HG215-LH-A）
冰浴，离心管盒
酶标仪BioTek（BioTek Instruments，型号：Epoch）
灭菌瓶，Fisherbrand（100 ml，Fisher Scientific，目录号：FB800100; 250ml，Fisher Scientific，目录号：FB800250; 500ml，Fisher Scientific，目录号：FB800500）
磁力搅拌棒
磁力搅拌板
pH计
孵化器，益恒（益恒，型号：LRH-1000F）

程序

样品制备
1. 样本收集
  整个协议使用L4阶线虫作为参考点。根据早先的报告（Solis和Petrascheck，2015; Yu等人，2017），遵循线虫文化和年龄同步。从1.6毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.0）的每个线虫生长培养基板（60毫米）上清洗L4阶段线虫到1.5毫升离心管中。在4℃下通过重力沉降30分钟后，小心地移出并丢弃上清液。加入500μl冰冷的PBS，用轻轻和重复的移液管再次悬浮沉淀，再沉淀15分钟。然后，丢弃上清液，加入500μl冰冷的PBS，用温和和重复的移液管重悬悬液，并在离心管中用200μlPBS中的20,50,100,200,300,400和500种线虫组分别使用以下步骤。
  以100条线虫为例。
2. 样本存储
  将管以5,000×g离心5分钟（4℃）。用移液管小心丢弃上清液PBS，并将颗粒在-26℃过夜或-80℃保存一周以上。
3. 样品均质
总蛋白测定
通过基于BCA方法的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量每个样品中的总蛋白（TP）。
1. 蛋白质标准品的准备工作
  使用库存蛋白质标准品（5mg / ml）制备0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2mg / ml稀释液，每个使用PBS100μl。
2. BCA工作解决方案的准备工作
  用BCA试剂A和B以50：1的体积比制备BCA工作溶液。 BCA工作溶液的总体积根据测试样品的量（每个样品200μl）计算。
3. 蛋白质浓度的测定
4. 数据计算
  根据标准曲线计算样品中的蛋白质含量线虫数与蛋白质浓度之间关系的一个介绍如图2所示
  
  图2.线虫数和线虫蛋白浓度之间的关系
SOD活性分析
通过基于WST-8方法的ELISA试剂盒测量每个样品中的SOD。 WST-8方法是基于WST-8的比色反应。在反应中，黄嘌呤氧化酶（XO）催化黄嘌呤的氧化转化，产生超氧阴离子，使WST-8猝灭，生成水溶性甲an（紫色染料）。由于SOD猝灭超氧化物阴离子，因此其活性抑制整体比色反应（见图3）。因此，抑制水平用于表示细胞，组织或其他生物样品中的SOD活性

图3. WST-8与黄嘌呤的超氧阴离子的比色反应，SOD活性抑制比色反应
1. 准备必要的解决方案
  根据制造商的ELISA试剂盒说明准备标准和控制措施以及工作解决方案。
2. 样品测定
3. SOD活性测定中的计算
  1. 抑制（％）=（空白对照1 标准或样品）/（空白对照1 空白对照2％）×100％。使用已知SOD活动的标准及其抑制来建立标准曲线。然后用曲线计算样品的SOD活性。标准曲线的一个例子如图4所示
    
    图4. WST-8比色反应的对数和抑制（％）SOD活性之间的关系
  2. 将每个线虫样品中的SOD酶活性作为同一样品的总蛋白（TP）的比例（P），以消除样品中线虫数的差异。线虫中标准化的SOD活性列在表1中。比例值一般在4.04〜4.35之间。具有20和50种线虫的组中的值比一般范围大得多。虽然这些值在平均值±3标准偏差（SD）之内，我们建议不要使用它们来避免不可靠性。这些结果表明，应使用至少100种线虫来确保测量SOD活动的可行性和稳定性。
    
    表1.标准化SOD活性与线虫号之间的连接
CAT活性测定
使用ELISA试剂盒测量每个样品中的CAT活性。测定原理是基于过氧化氢酶分解过氧化氢（H 2 O 2 O 2）的反应。过量的H 2 O 2 O 2可以与钼酸铵形成络合物以产生淡黄色溶液。溶液在450nm处的吸附可用于计算H 2 O 2 O 2的浓度，因此间接显示CAT活性。
1. 试剂准备
  根据制造商的ELISA试剂盒说明，在测定前准备所有试剂，并根据样品数量，标准品和对照进行仔细计算。
2. 添加标准品或样品
  将50μl标准品或样品加入96孔板中。使用50μlPBS作为空白对照。建议所有标准，样品和对照至少进行两次重复。值得注意的是，每个线虫样品在样品均质化步骤之后被处理并分成4个等分试样。使用一个等分试样以确保重复，并避免重复冻结样品。标准浓度分别为400,100,25,6.25,1.5625,0.4和0.1U / L
3. 酶缀合
  在含有标准品，样品和空白的孔中加入100μl酶偶联物。然后通过密封胶带密封胶水，避免水分蒸发，并在37℃静置孵育微孔板60分钟。
4. 洗
5. 添加底物
  使用多通道移液管向每个孔中加入50μl底物A和50μl底物B。在37℃下在黑暗中孵育微孔板15分钟
6. 端点测量
  向每个孔中加入50μl终止溶液。孵育1分钟后，在15分钟内用酶标仪测量450nm处的吸光度
7. 数据计算和呈现
  根据标准曲线计算样品总CAT活性（见图5），其方法与SOD活性测定法相似。
  
  图5. H＆lt;＆gt;＆lt; 2＆gt; O 之间的比色反应的对数和抑制（CAT）之间的总CAT活性之间的关系> 2 钼酸铵
  
  将每个线虫样品中的CAT活性作为同一样品的总蛋白（TP）的比例（P），以消除样品中线虫数的差异。线虫中归一化的CAT活性列在表2中。比例值一般在8.74至10.36之间。具有20和50个线虫的组中的值显着大于该范围。这些结果表明，应使用至少100种线虫来确保测量CAT活动的可行性和稳定性
  表2.标准化CAT活动与线虫号之间的连接

数据分析

数据分析程序是指我们以前的报告（Yu等人，2013b）。首先，在至少三次重复测量每个样品的一个等分试样中的线虫总蛋白（TP）的值，并计算这些TP值（TP平均值）的平均值，以表示样品中的TP浓度。其次，同样样品的其他等分试样中的SOD（或CAT）值也至少在三次重复中测量。第三，将每个重复数据中的SOD（或CAT）值计算为其与TP平均值的比例，以获得SOD（或CAT）比例值。第四，计算SOD（或CAT）比例值以获得样品中的平均SOD（或CAT）比例和相应的标准误差。
在样品来自不同处理的情况下，来自对照的样品中的平均SOD（或CAT）比例归一化为100％（或1.0）;然后，化学暴露样品中的SOD（或CAT）比例转化为对照（POC）的百分比（或折叠对照的变化）;接下来，使用样本中的POC值（或折叠变化）来计算平均POC和相应的标准误差。
应从至少三次独立重复实验收集线虫样品，每个实验中都有一组数据。通过这些独立重复的实验，在对照组中的平均SOD（或CAT）比例和化学暴露量之间进行ANOVA（Origin 9.0，Origin Lab Corp.，USA）。 0.05的概率水平被认为具有统计学意义（P <0.05）

笔记

当从线虫生长培养基板收集线虫时，蠕虫浆液中的细菌会对测定产生问题。因此，不要使用离心，而是使用重力沉降来进行样品收集。为了完全摆脱细菌，轻轻洗涤沉淀（即重悬/沉淀 - 弃去上清液）几次。
记住要避免对线虫的不必要的压力。一方面，使用冰冷的PBS来减轻蠕虫的压力。另一方面，最好是花费更少的时间来转移和其他表演，训练有素的处理。使用多通道移液器同时添加所有溶液，以缩短样品间反应时间的差异。此外，保持所有样品具有相同的性能，以确保样品之间的可比性。
考虑到蠕虫会粘附在尖端，并且它们倾向于重力沉降，每当转移蠕虫时，都会以平缓和重复的移液来重悬。这样，我们可以确保管中的蠕虫密度是均匀的，并且粘附到尖端的蠕虫也能够在没有进一步粘附的情况下达到平衡。
为了确保重现性和变异性，每个管中应至少有100根线虫
来自100种线虫的均质化PBS溶液的上清液足够用于四个等分试样，其对于包括总蛋白质的四种生物化学测定是足够的。如果同时进行更多的生化测定，则线虫数量应该增加
蛋白质标准溶液的蛋白质浓度范围可以根据初步实验进行改变，特别是在不计算线虫数的情况下。
当均匀化线虫样品时，在不同样品中以均匀的方式处理杵。以相同的持续时间（10秒均化+ 2秒冷却+每个管均匀10秒）保持相同强度的运动，以提高数据的再现性。此外，在将其用于另一根管子之前清洁杵，并在整个均质程序中保持清洁程序均匀将杵（用于随后均匀化）放入冰冷的PBS中。每次使用后，用冰冷的水清洗杵，并将其放回干净的冰冷PBS中。这种性能将确保杵的清洁度，并避免室温杵对样品蛋白质稳定性的潜在影响。
如果每个管中的线虫数大于500，则匀浆程序的持续时间应延长至正常时间的至少两倍（例如，10秒磨削+ 2秒冷却+ 10秒磨削+ 2秒冷却+ 10秒磨+ 2秒冷却+10秒磨）。杵应该用400μlPBS洗涤。通过这种方式，可以确保均质效率，并且可以稀释上清液中的总蛋白质浓度，以更好地进行生化测定。
在预防水分蒸发时，一个潮湿的房间将会有所帮助

食谱

Clorox解决方案
以30毫升为例。它由0.6g NaOH，5ml NaOCl（6-14％活性Cl）和25ml去离子H 2 O 2组成，最终浓度为0.5M，NaOH和NaOCl为〜1％，分别是
磷酸盐缓冲盐水/缓冲液（PBS），pH 7.0
如果没有可用的混合，那么请解决如下：

溶液A：在灭菌的无菌瓶中的无菌去离子水中，溶解17.418g K 2 N 2 HPO 4（FW = 174.18）
溶液B：在灭菌的无菌瓶中的灭菌去离子水中将13.689g KH 2 PO 4（FW = 136.89）溶解在无菌的去离子水中
在磁力搅拌板上带有磁力搅拌棒的2000毫升烧瓶中，加入750毫升溶液B.打开磁力搅拌装置后，小心地将pH计的探针放在水面下面和磁力搅拌器上方。然后缓慢加入溶液A，并同时监测pH变化，直到pH达到7.0
如果pH超过7.0，缓慢加入更多的溶液B，直到pH值回到7.0

致谢

作者非常感谢中国国家自然科学基金（21307095号，21407061），国际科学技术大学中国技术合作计划（No. 2016YFE0123700），区域环境质量合作创新中心和瑞典研究理事会（合同639-2013-6913）。

参考

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Carretero，M.，Solis，GM，Petrascheck，M。（2017）。 ℃。线虫作为药物发现的模型。 Curr Top Med Chem 17：1-10。

Dengg，M.and van Meel，JC（2004）。秀丽隐杆线虫作为药物化合物的快速毒性评估的模型系统。药物毒理学方法 50（3）：209-214。

Feng，S.，Cheng，H.，Xu，Z.，Shen，S.，Yuan，M.，Liu，J.and Ding，C.（2015）。三七总皂甙多糖对秀丽隐杆线虫的耐热应力和老化作用< / em>。 Int J Biol Macromol 81：188-194。

Solis，GM和Petrascheck，M。（2015）。测量96孔微量滴定板中的秀丽隐杆线虫的寿命。 J Vis Exp 49：e2496。

Yu，Z.，Chen，X.，Zhang，J.，Wang，R. and Yin，D（2013a）。重金属对秀丽隐杆线虫的L3幼虫的跨代影响，在后代中具有更大的行为和生长抑制作用。 > Ecotoxicol Environ Saf 88：178-184。

Yu，Z.，Sun，G.，Liu，Y.，Yin，D. and Zhang，J.（2017）。磺胺甲恶唑对秀丽隐杆线虫的寿命，繁殖和人口增长的跨代影响。生态毒素环境保护 135：312-318。

Yu，ZY，Zhang，J. and Yin，DQ（2012）。各种食源性传播途径和水传播途径，铜对秀丽隐杆线虫的毒性和恢复作用。 87（11）：1361- 1367.

Yu，Z.，Zhang，J.，Chen，X.，Yin，D.and Deng，H。（2013b）。抑制产后暴露于微摩尔浓度的磺酰胺的线虫后代的行为和生长危害物质 250 -251：198-203。

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