材料和试剂

10厘米板（TPP Techno Plastic Products，目录号：93100）
6孔板（TPP Techno Plastic Products，目录号：92006）
10ml移液器（Bioswisstec，目录号：515210）
5ml移液器（Bioswisstec，目录号：515205）
15ml Falcon管（Greiner Bio One International，目录号：188271）
玻璃巴斯德移液器（HUBERLAB，目录号：1.1127.01）
小鼠胚胎干细胞（得自ATCC：ES-E14TG2a的E14TG2a mESC系）（ATCC，目录号：CRL-1821）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）1X（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010015）
胰蛋白酶-EDTA 0.05％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25300054）
碱性磷酸酶试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：86R-1KT）
ddH 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：99053）
注意：本产品已停产。
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6429）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
白血病抑制因子（LIF）10百万单位/ ml（默克，目录号：ESG1107）
2-巯基乙醇（βM）50mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31350010）
青霉素和链霉素（PS）的混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
N2B27（Takara Bio，目录号：Y40002）
MAPK / ERK抑制剂0.4μM（PD03）（Stemolecule PD0325901）（STEMCELL Technologies，目录号：72184）
GSK3β抑制剂3μM（Chiron）（Stemolecule CHIR99021）（STEMCELL Technologies，目录号：72054）
丙酮（Merck，目录号：1.00014.1000）
甲醛37％（Sigma-Aldrich，目录号：47608-1L-F）
0.2％明胶溶液（见配方）
MES培养基（见食谱）
MEF培养基（见食谱）
2i + LIF培养基（参见食谱）
固定溶液（参见食谱）
底物溶液（参见食谱）

设备

Heracall TM 150i培养箱（37℃和8％CO 2）（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracall TM 150i）
离心机（Eppendorf，型号：5810）
组织文化罩（FASTER，型号：Safe FAST Premium 209，目录号：F00024900000）
Millipore权杖 2.0细胞计数器（EMD Millipore，型号：Scepter TM 2.0，目录号：PHCC00000）（或任何细胞计数器）
倒置显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TS100）

软件

ImageJ软件1.48v
Adobe Photoshop CS6
GraphPad Prism 6.0a软件

程序

维持mESCs
1. 在37℃下在8％CO 2培养箱中将mESC常规培养在用0.2％明胶（参见食谱）预先包被在10ml MES培养基（参见食谱）中的10cm皿上（图1A ）。
2. 介质每隔一天更换一次。
  注意：应特别注意避免在维持培养中汇合（> 70％）的mESCs（图1B），否则可能导致细胞的有害分化。
  
  图1. mESCs的典型形态。无饲料未分化的mESC显示为低20-30％（A）和高60-70％（B）密度。健康的，紧急的mESCs生长形式紧密，遍及通过（A）的折射菌落。过度融合（> 70％）的mESCs（B）产生平坦的集落形态和潜在的分化。
退出多能测定
1. 用0.2％明胶（500μl/孔）包被6孔板，并验证明胶分布良好。将板放在培养箱中。
2. 从50％汇合的mESCs 10厘米盘中取出培养基。用4ml 1x PBS洗涤一次。向细胞中加入2ml胰蛋白酶-EDTA，验证胰蛋白酶分布良好。将细胞放回培养箱中5分钟。在显微镜下验证mESC菌落与盘分离。
3. 加入4 ml的MEF培养基（参见食谱）到培养皿中以灭活胰蛋白酶。使用5ml移液器轻轻地上下实现单个细胞，并将它们移动到一个15毫升的Falcon管中。
  注意：尝试实现单细胞悬浮液，并小心避免太多气泡。
4. 使用细胞计数器或等效方法计数细胞密度。
5. 在新管中以200g离心2×10 4个细胞5分钟。
  注意：所有的离心机都是在室温下进行。
6. 使用2ml 2i + LIF培养基小心地重悬细胞沉淀（参见食谱）。
7. 在含有0.2％明胶的6孔预包被的平板中，将2×10 4细胞培养板放入2ml的2i + LIF培养基中。媒体每隔一天更换一次。
  注意：
8. 3天后，吸入2i + LIF培养基而不扰乱mESC菌落（第3天），并加入N2B27培养基（不含LIF或抑制剂）4天（允许培养基）。媒体每隔一天更换一次。
9. 在第7天，除去N2B27（许可培养基）培养基，而不干扰mESC菌落，并再次引入2i + LIF培养基3天。介质每隔一天更换一次。
10. 在第10天，可以进行碱性磷酸酶染色（图2）
  
  图2.从多能性测定出来后的碱性磷酸酶（AP）染色。：一种。野生型mESCs AP染色后6孔全部;野生型mESCs是无色和/或分化的; C.Dgcr8_KO mESCs AP染色后全6孔; D.Dgcr8_KO mESCs不能退出多能性，呈现紫色和未分化; E.从多能性测定出来后细胞的阳性克隆AP染色数。
碱性磷酸酶染色
1. 用巴斯德吸管吸出2i培养基。
2. 每孔用1ml 1×PBS清洗细胞。
  注意：注意不要从盘子上清除菌落。
3. 用0.5ml固定溶液小心固定细胞45秒（参见食谱）。
  注意：长时间固定会破坏碱性磷酸酶活性。
4. 用0.5ml ddH 2 O洗涤细胞两次。
  注意：注意不要从盘子里清除菌落。
5. 在黑暗中（抽屉或铝箔）在室温下加入0.5ml底物溶液（参见食谱）15分钟。
6. 用0.5ml ddH 2 O洗涤。
7. 让盘子在抽屉里空气干燥。
克隆碱性磷酸酶阳性数量化
1. 用打印机/扫描仪扫描用于碱性磷酸酶染色的整个6孔板以捕获单个图像中的总板面积（图2A和2C）。还可以用显微镜获取更详细的图像，以更好地观察不同细胞系中的形态和碱性磷酸酶染色强度（图2B和2D）。
2. 扫描的PDF图像使用Adobe Photoshop CS6转换为TIFF图像。
3. 使用ImageJ软件1.48v处理图像如下：

数据分析

克隆AP阳性菌落的数目表示为±SEM。统计学差异可以通过Student's 测试来测量。值 0.05被认为是显着的。可以使用GraphPad Prism 6.0a软件进行数据分析。 AP染色必须一式三份进行。包含上述协议的原始研究论文是Cirera-Salinas等人，2017和Bodak等人，2017。

笔记

上述方案已被设计用于具有强增殖缺陷的RNAi突变体mESC。如果使用其他鼠标ESC线，我们建议首先使细胞系适应2i介质。适应时间对于良好贴壁细胞系而言为3天，如果细胞难以附着在板上，则为5-7天。如果mESC系不适合，在培养箱中用0.2％明胶处理板24小时，然后将其平板。当细胞适应于2i培养基时，细胞的形态学是适应性的良好指示，因为细胞变得非常圆。通常，mESCs在许可培养基中需要2天才能从多能性中退出。最后，独立于使用的细胞系，在用碱性磷酸酶染色之前，需要3天的2i培养基。

食谱

0.2％明胶
用500ml ddH 2 O稀释1g来自猪皮肤的明胶，充分混合，然后高压釜溶液
MES中等
MEF中等
2i + LIF媒体
固定溶液（15 ml）
12.25毫升丙酮 3.92ml柠檬酸盐（提供来自Sigma-Aldrich试剂盒的25mM溶液）
1.5 ml 37％甲醛
底物溶液（3ml）
2.81ml ddH 2 O
62.5μl亚硝酸盐（由Sigma-Aldrich试剂盒提供）
62.5μlFRV（由Sigma-Aldrich试剂盒提供）
62.5μlNapthol（由Sigma-Aldrich试剂盒提供）
注意：底物亚硝酸盐（1st），FRV（2nd）和Napthol（3 rd ）的顺序是重要的。在将细胞添加到细胞之前，液体必须是黄色的。

致谢

该协议最初是作为Cirera-Salinas等人的一部分出版的。（2017）。作者希望感谢Bodak博士的富有成效的讨论。 D. C-S由Peter和Traudl基金会的博士后研究金支持。

参考

Betschinger，J.，Nichols，J.，Dietmann，S.，Corrin，PD，Paddison，PJ和Smith，A.（2013）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http： .ncbi.nlm.nih.gov / pubmed / 23582324“target =”_ blank“>从多能性退出是通过bHLH转录因子Tfe3的细胞内再分配来选择的。细胞 153（2）：335-347。
Bodak，M.，Cirera-Salinas，D.，Yu，J.，Ngondo，RP and Ciaudo，C.（2017）。 Dicer，小鼠胚胎干细胞中多能性出口和LINE-1元素的新调节因子。 FEBS Open Bio 7（2）：204-220。

Cirera-Salinas，D.，Yu，J.，Bodak，M.，Ngondo，RP，Herbert，KM and Ciaudo C.（2017）。 DGCR8的非规范功能可以控制mESCs从多能性中退出。。

Ying，QL，Stavridis，M.，Griffiths，D.，Li，M. and Smith，A.（2003）。将胚胎干细胞转化为粘附单一培养物中的神经外胚层前体。生物技术<21>（2）：183-186。 br />

Ying，QL，Wray，W.，Nichols，J.，Battle-Morera，L.，Doble，B.，Woodgett，J.，Cohen，P.和Smith，A.（2008）。胚胎干细胞自我更新的基础状态自然 453（7194）：519-23。