材料和试剂

移液瓶提示200μl（CientíficaSenna，目录号：5-20236）
96孔微板聚丙烯（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：267245）
玻璃显微镜幻灯片（康宁，目录号：2947-75X25）
Coverslip（康宁，目录号：2890-22）
注意：本产品已停产。
铝箔（雷诺缠绕15米×30厘米）
CellROX ®绿色试剂（Thermo Fischer Scientific，Invitrogen TM，目录号：C10444，激发/发射，485/520nm）
Triton X-100（Karal，目录号：9015）
茉莉酸甲酯（缩写为MeJA）（Sigma-Aldrich，目录号：392707-5ML）
硝酸钾（KNO 3）（Karal，目录号：5082）
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Karal，目录号：6056）
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）（Karal，目录号：5080）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Karal，目录号：2016）
乙二胺四乙酸铁钠盐（Fe·Na·EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6760-100G）
硫酸（H 2 SO 3 SO 4）（Karal，目录号：1032）
硼酸（H 3 3 BO 4）（Karal，目录号：7021）
硫酸锰一水合物（MnSO 4·H 2 O）（Karal，目录号：1069）
硫酸锌一水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Karal，目录号：4089）
五水合硫酸铜（CuSO 4·5H 2 O）（Karal，目录号：8024）
钼酸钠二水合物（NaMoO 4·2H 2 O）（Karal，目录号：4072）
硫酸钴（II）七水合物（CoSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：12933）
注意：本产品已停产。
氯化钠（NaCl）（Karal，目录号：6052）
氯化钾（KCl）（Karal，目录号：5087）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Karal，目录号：5010）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Karal，目录号：6005）
修改的CHU-13介质（见配方）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

1.5升烧瓶（Corning，PYREX ，目录号：4980-1XL）
微量移液器（Mettler-Toledo International，Rainin ®，目录号：17014392,17014382和17011790）
培养箱振荡器（选择BioProducts，型号：IncuMix TM培养箱振荡器，目录号：SBS256）
离心机（Labnet International，型号：Spectrafuge TM 16M，目录号：C0160）
配备了用于荧光染料激发的470nm LED模块的光学显微镜（ZEISS，型号：Axio Lab.A1）和一组38个Endow GFP过滤器（自由交换（E）EX BP 470/40，BS FT 495，EM BP 525 / 50）以检测荧光染料的排放
数码相机（ZEISS，型号：AxioCam ICc3 Rev.3）
pH计（Cole-Parmer，Jenway，型号：3510）
高压灭菌器（市场锻造行业，型号：STM-EL）

软件

ZEN lite 2011（ZEISS）
GraphPad Prism版本6.00适用于Mac OS X，GraphPad Software，La Jolla California USA（ http：// www .graphpad.com ）

程序

在特定压力处理后的不同时间点收获在改良的Chu-13培养基（见食谱）中生长的藻类培养物样品。在显微镜下应该清楚地观察到100μl中足够的菌落。如果您的藻类在离心后可以沉淀，100μl应至少制成20μl的颗粒。如果藻类不像B那样沉淀。 braunii ，由于周围的碳氢化合物而漂浮，则600nm处的OD应至少为0.5。如果需要，通过离心，过滤或其他适合您样品的方法浓缩细胞。
在96孔微量培养板中转移100μl各样品，并与2μl5mM CellROX Green混合，在37℃下，在培养箱中以120rpm摇动，在黑暗中孵育30分钟。
然后倾斜板，用微量移液管小心地丢弃液体，并在室温下以120rpm摇动5分钟，用含有0.1％Triton X-100的100μl1x PBS（参见食谱）洗涤细胞两次。 Triton X-100是广泛用于透过活细胞膜的实验室中常用的洗涤剂。
将10-20μl每个样品的等分试样转移到玻璃显微镜载玻片上，盖上盖玻片，并在显微镜下观察。
首先在白光下观察样品以定位藻类菌落，然后切换到荧光条件。每个样本计数至少100个菌落。
具有更多90％具有荧光核的细胞的殖民地被认为是ROS阳性
使用数码相机拍照，代表图像如下图所示（图1）

图1.用CellROX染料染色乳香葡萄球菌。通过分析B的荧光核，检测体内的ROS 。 braunii 细胞在每个殖民地。上面板在白光下，下面板处于荧光条件下。控制无压力处理; B.用强应力诱导剂治疗（10μMMeJA 60分钟）; C.用弱应力诱导剂（120mM NaHCO 3，60分钟）处理。
根据以下方程确定ROS阳性菌落的百分比：

（FC / TC）x 100 =％PC

其中，FC =具有荧光的菌落数，TC =观察到的菌落总数，PC = ROS阳性菌落的百分比。

数据分析

通过该方法，诱导剂的浓度和诱导时间都被优化。通过计数用不同处理诱导的荧光细胞10,60和120分钟来确定CellROX染色后的ROS阳性菌落数。数据表示至少三次重复的平均值±SE。统计显着性用Tukey's检验（P 值= ** 0.0022，*** 0.0003，**** <0.0001）进行评估。统计测试使用GraphPad Prism版本6.00 for Mac OS X，GraphPad Software，La Jolla California USA执行（ http://www.graphpad.com ）。使用Microsoft Excel for Mac 2011版本14.1.0可视化数据。 ROS的阳性菌落数以％阳性菌落表示（表1）
表1. ROS阳性百分比B。 Braunii 菌落。在不同时间和不同浓度的诱导物中取样。

这些数据表明，对于10μMMeJA以及120mM NaHCO 3的检测，检测胸膜布鲁氏杆菌的ROS阳性菌落的最佳条件为60分钟。然而，关于诱导剂的时间和浓度的最佳条件必须对其他微藻确定。

笔记

即使没有治疗任何应激诱导剂，也将少量菌落鉴定为ROS阳性，这可能是由于在处理样品期间的损害。然而，它们不超过分析的总菌落的13.5％，并且低于在任何所测试的处理中观察到的菌落数。
由于B的殖民地组织。 braunii 有时难以在选定样品中计数单个细胞，而不在显微镜下移动场。因此，一旦野外在荧光灯下固定，如果现场超过90％的细胞具有荧光核，则将菌落视为ROS阳性。建议尝试不同的重点在同一个殖民地区分细胞在不同的平面染色的核
在洗涤步骤中加入Triton X-100，以改进将CellROX Green引入到B中。胸罩细胞。在该步骤的步骤2中，当添加染料时，其覆盖并结合到菌落的表面，但很难进入其内部细胞。在步骤3中，Triton X-100允许通过其洗涤剂性质引入染料。这是一个关键步骤，因为这个藻类分泌了大量围绕细胞的液体烃，产生了高度疏水的细胞外环境。在洗涤步骤中，染料到达内细胞以检测ROS，并且丢弃多余的CellROX。在我们手中，第二次洗涤后，反应停止，因为用染料检测到所有产生的ROS。也许，其他微藻不需要这一步，虽然它可能有助于获得更好的结果，主要是如果文化被迫产生大量的脂质。

食谱

修改CHU-13媒体
0.4g / L KNO 3
0.1g / L MgSO 4·7H 2 O→/ / 0.052g / L K 2 HPO 4
0.054g / L CaCl 2·2H 2 O
0.01g / L Fe·Na·EDTA
5 ml / L痕量元素
将每个盐溶解在800ml去离子水中。使用稀释的H 2 SO 4将pH设定为7.2-7.5。介质的pH应超过7.0，不能用NaOH调节。如果pH低于7.0，请丢弃溶液并再次准备微量元素：
572mg / L H 3 BO 4
308mg / L MnSO 4·H 2 O
44mg / L ZnSO 4·7H 2 O
16mg / L CuSO 4·5H 2 O
12mg / L NaMoO 4 / 2H 2 O 18mg / L CoSO 4·7H 2 O
在1.5升烧瓶中将900ml去离子水全部混合，用铝箔覆盖，并在121℃高压灭菌20分钟消毒。
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
8克/升NaCl
0.2克/升KCl
1.44g / L Na 2 HPO 4
0.24g / L KH 2 PO 4
将试剂溶于800毫升去离子水中。用HCl调节pH至7.4（或7.2，如果需要），然后将H 2 O加至1L。在121℃下通过高压灭菌20分钟灭菌或通过过滤灭菌灭菌。在室温下储存PBS

致谢

该技术根据Life Technologies Corp.的CellROX Oxidative Stress Reagents Man0003555手册中描述的原始程序改编。该工作得到了Consejo Nacional de Ciencia yTecnología的IC-C博士学位奖学金的支持（CONACYT）墨西哥，并从德克萨斯A＆amp; M大学CONACYT合作研究授权计划授予EL-G和TPD。

参考

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