材料和试剂

无菌1.5ml管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
25 G针
50ml注射器（B.Braun Medical，目录号：4617509F-02）
聚丙烯锥形50ml离心管（TPP Techno Plastic Products，目录号：91050）
40μM电池过滤器（Corning，Falcon ®，目录号：431750）
90 mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：101RTC）
96孔清除的底部细胞培养级黑色成像板（Corning，Falcon ®，目录号：353219）
无菌试剂库（VWR，目录号：89094-664）
10ml血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
25 ml血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1685.001）
10μl过滤屏障尖端（Biotix，Neptune ®，目录号：BT10XL）
200μl过滤提示低保留（CLEARLINE，目录号：713117）
0.22μm注射器过滤器（Carl Roth，目录号：P668.1）
胶版印章
6至9周龄特异性病原体免费C57BL / 6小鼠
ddH 2 O
乙醇
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）（ImmunoTools，目录号：12343115）
EDTA 0.5M pH 8.0溶液（如参考文献1所述）
药用抑制剂
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10270106）
HEPES缓冲液（BioConcept，目录号：5-31F00-H）
青霉素 - 链霉素（P / S）（BioConcept，目录号：4-01F00-H）
Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31966021）
氢氧化钠（NaOH）
盐酸（HCl）
对甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：76240）
注意：本产品已停产。
细胞培养级Ca / Mg的Dulbecco's PBS（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14040091）
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：84510）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：D1306）
鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：A12379）
完成DMEM细胞培养基（参见食谱）
4％PFA溶液（见配方）
5％皂苷溶液（见配方）
染色溶液（参见食谱）

设备

10-11厘米长不锈钢解剖剪刀
10-11厘米长不锈钢解剖直镊
冰箱离心机带50ml管接头
细胞培养箱
移液器控制器
移液器
细胞计数室
Finnipipette ® 50-300μl12通道多吸管器
化学罩
流明罩
洗板机（BioTek Instruments，型号：EL406）
高含量显微镜（如Molecular Devices，型号：ImageXpress Micro XL）
40x计划Apoλ0.95 NA目标（尼康，目录号：MRD00405）
pH计

程序

鼠骨髓衍生巨噬细胞的制备
1. 使用二氧化碳安乐死小鼠。在手术过程中，将剪刀和镊子放在70％乙醇中。在中央背部做一个小切口。从每个后腿的顶部剥下皮肤，然后从脚上往下。用剪刀切断髋骨后腿。仔细切断脚和髋骨，而不损害胫骨和股骨的完整性。通过在关节处切断分离胫骨和股骨。
2. 从胫骨和股骨去除多余的肌肉。用镊子握住骨头并用70％乙醇喷雾。
3. 将骨头放在含有P / S的冰冷DMEM的无菌管中。将管保持在冰上。
4. 使用镊子，将骨头浸泡在70％乙醇中几秒钟。等待多余的乙醇滴下，然后用剪刀切割骨骼的各个末端以暴露骨髓腔。
5. 使用连接到含有25ml冰冷的完全DMEM培养基（参见食谱）的50ml注射器上的25G针头冲洗骨髓，到无菌的50ml规格的离心管中。将样品通过40μm的细胞过滤器过滤到冰上新鲜的50ml管中。
  注意：在良好的细胞培养实践之后，所有液体步骤必须使用无菌和无热原材料在层流罩下进行，以避免巨噬细胞的活化。
6. 在450℃离心细胞4分钟4分钟。
7. 通过一次移动反转管，弃去上清液。将细胞重悬于含有50ng / ml M-CSF的冰冷的完全DMEM中
培养巨噬细胞
1. 在含有M-CSF的完全DMEM中计数细胞并将细胞数调节至〜7×10 6 / ml。在最终体积为10ml的含有M-CSF的完全DMEM的培养皿中加入〜7×10 5个细胞。在37℃，5％CO 2培养箱中孵育培养皿。
2. 在第3天，向每个板中加入5ml新鲜预热（37℃）的含有50ng / ml M-CSF的完全DMEM。
收获巨噬细胞
1. 在第6天，丢弃培养上清液。立即加入10毫升冰冷的细胞培养级无菌1x PBS，不含钙和镁，含有5 mM EDTA的pH 7.4。孵化培养皿〜3分钟冰。
2. 以30°C的角度握住培养皿。使用移液器控制器和无菌移液管冲洗培养皿及其内容物。将分离的细胞转移到含有转运体积的完全DMEM的六分之一的50ml无菌管中。
3. 在4℃下以200×g离心管8分钟。
4. 使用细胞计数室或自动细胞计数器计数细胞。将细胞浓度调整至1.25×10 6细胞/ ml。
电镀巨噬细胞
使用多通道移液管或层流罩下的自动细胞分配器将100μl细胞移至96孔透明的底部黑色板中（图1）。在培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育细胞过夜以确保细胞附着。
注意：细胞应分配在孔的边缘以具有均匀分布。必须避免板块的振动或旋转，以防止孔中某些区域的细胞积聚（图2）。

图1.液体的吸入和分布应在板的边缘进行。将板与表面保持约30°的角度，并将液体吸入或分配到井中时，将多面吸管以120°的角度握住，以避免细胞脱落。

图2.来自井的7×7瓦片图像的示例。 A和B.显示可能由细胞电镀，板振动/旋转和/或吸入/分散引起的异质细胞分布。 C.显示均匀的细胞分布。图像显示DAPI染色的巨噬细胞荧光核
治疗巨噬细胞
1. 可以用优化的浓度的药物抑制剂预处理细胞或治疗优化的持续时间。在预处理的情况下，用预热的37℃完全DMEM洗涤孔，并加入100μl完整的DMEM。
  注意：
  1. 介质的抽吸和分散步骤必须在井的边缘进行，以避免分离单元（图2）。
  2. 按照该方案，进行选择性药理学抑制剂的双重连续稀释以确定初级巨噬细胞的无毒浓度。在实验的时间过程中使用适当的生物化学和/或细胞实验方法测定药物抑制剂在确定浓度下的效力。我们可以推荐使用1μM星形孢菌素（阴性对照）诱导巨噬细胞死亡和10-50ng / ml M-CSF（阳性对照）诱导巨噬细胞存活和增殖。
2. 在100μl完整的DMEM中用感兴趣的刺激物处理细胞。孵育细胞在37℃，5％CO 2 注意：孵化的持续时间需要针对每个单独的实验装置进行优化。应该注意的是，在细胞培养基培养48小时后，巨噬细胞数量基本减少。
固定，染色和洗涤步骤
1. 使用多通道移液管或自动洗板器吸出细胞上清液。
2. 在1x PBS，pH 7.4中分配50μl4％PFA（参见食谱），并在室温下孵育平板10分钟。
3. 使用多通道移液器或自动洗板机，用200μl1x PBS洗涤孔两次。
4. 吸取上清液，分配50μl染色溶液。使用染色溶液（见食谱）在黑暗的地方孵育平板10分钟。
5. 使用多通道移液器或自动洗板机，用200μl1x PBS冲洗两次。
6. 密封板用粘合板手动密封或使用自动化板材封口机。
图像采集
1. 用70％乙醇清洗每个96孔板的底部。
2. 使用配备40x物镜的高含量显微镜，每孔获取49张图像，其中包括7 x 7图像，彼此间隔200μm。
用核和F-肌动蛋白染色计数细胞
1. Metaexpress的细胞评分对象功能用于分割和定义所有细胞核（DAPI通道）。作为阳性标记，使用细胞质染色（鬼笔环肽通道）（图3A）。 “全核”和“正标记”参数的近似最小和最大宽度设置为5μm和30μm（图3B）。
  注意：可以使用ImageJ，Icy或Cell-profiler进行图像分析，这是免费的图像分析程序。
2. 执行合并细胞核和细胞质对象的逻辑操作，以将细胞定义为算法中的对象（图3B）。
3. 从图像中除去具有与图像相邻的细胞质的细胞，仅在视野中计数细胞（图3B）。
4. 细胞计数作为图像分析管线的输出数据。
  
  图3.图像处理和对象分割管道。：一种。未处理的DAPI，鬼笔环肽和复合图像; B.显示细胞核和细胞质的物体分割。细胞通过合并细胞核和细胞质二值图像来定义。在用于量化细胞数量的最终处理图像中移除接界细胞。

数据分析

每个独立的实验应该用三个技术或生物重复进行。为了汇集独立实验，如果使用药理学抑制剂，则可以将数据归一化为未处理状态下的细胞计数或载体处理条件下的细胞计数。条形图和适当的统计测试可用于表示数据。

食谱

完成DMEM细胞培养基
50ml FBS
5 ml HEPES
5 ml P / S
500毫升DMEM
使用0.22μm过滤器和50 ml注射器将FBS，HEPES和P / S过滤到DMEM中
4％PFA溶液
45毫升ddH 2 O O 1 N NaOH
1 N HCl
5 ml 10x PBS
2克PFA
热ddH 2 O至60℃。在化学罩下搅拌的同时，将2g PFA加入管中。加入几滴1N NaOH。等待解决方案变得清晰。加入10倍PBS，使用pH计和1N HCl调节pH至7.4。使用0.22μm和50 ml注射器过滤溶液。等分并储存于-20°C
5％皂苷溶液
50ml 1x DPBS
2.5克皂苷
通过搅拌溶解皂苷。使用0.22μm和50 ml注射器过滤溶液。等分并储存于-20°C
染色溶液
5μg/ ml DAPI（核酸染色）（库存浓度5mg / ml）
1 U / ml鬼笔环肽（F-肌动蛋白染色）（原料浓度200 U / ml）
0.05％（w / v）皂苷（原料浓度5％，w / v）
1x DPBS，pH 7.4

致谢

感谢Dimitri Monreau和Cansel Ustunel Eren协助高分辨率显微镜和Slavica Masina对手稿的批判性阅读。我们感谢NCCR Geneva Access平台为高含量显微镜实验提供设备。这项工作由瑞士国家研究基金（FNRS 310030-153204和IZRJZ3_164176，N.F.），关节炎研究所（iAR）和COST行动（CM1307 SEFRI：C14.0070，N.F.）的资助提供资助。该方案根据Eren等人（2016）中描述的方案改编。

参考

EDTA。＆NBSP;（2006）。 Cold Spring Harbor Protoc pdb.rec8030。
Eren，RO，Reverte，M.，Rossi，M.，Hartley，MA，Castiglioni，P.，Prevel，F.，Martin，R.，Desponds，C.，Lye，LF，Drexler，SK，Reith，，Beverley，SM，Ronet，C。和Fasel，N。（2016）。哺乳动物的先天性免疫应答利什曼原虫病毒RNA病毒增加巨噬细胞存活以促进寄生虫持久性。细胞宿主微生物 20（3）：318-328。

Ginhoux，F。和Jung，S.（2014）。单核细胞和巨噬细胞：发育途径和组织体内平衡。 Nat Rev Immunol 14（6）：392-404。

Medzhitov，R。（2008）。起源和生理角色的炎症。自然 454（7203）：428-435。