材料和试剂

5cm无菌细胞培养皿（例如，Corning，Falcon ，目录号：353002）
可选的：一次性塑料冷冻模型（例如，Tissue-Tek Cryomold，Electron Microscopy Sciences，目录号：62534-25）
15ml和50ml离心管（例如，Crystalgen，目录号：23-2265; Corning，Falcon，目录号：352098）
24孔细胞培养板（Greiner Bio One International，目录号：662160）
细胞培养瓶，75cm 2（例如，Corning，Falcon，目录号：353136）
巴斯德玻璃移液器（例如，Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：63A54）
无菌移液器吸头（例如，，康宁）
细胞过滤器70微米（例如，Corning，目录号：431751）
0.2ml PCR条带管（例如，Corning，Axygen，目录号：PCR-0208-CP-C）
96孔反应板（例如，Thermo Fischer Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4346907）
光学粘合膜（例如，Thermo Fischer Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4311971）
具有可触知肿瘤的乳腺肿瘤小鼠（例如，MMTV-PyMT（Guy等人，1992）））。最佳肿瘤大小直径约5-10毫米
200证明乙醇（例如UltraPure，目录号：200CSPTP）
无菌水
冰
Matrigel生长因子降低基底膜基质，无酚红（Corning，目录号：356231）
可选：Tissue-Tek O.C.T.化合物（Electron Microscopy Sciences，目录号：62550-12）
液体N 2
细胞回收溶液（Corning，目录号：354253）
1x DPBS（例如，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190250）
TRIzol（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15596018）
GlycoBlue（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9516）
用于cDNA合成的DNA酶I，扩增级，例如Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：18068015）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）
胎牛血清（FBS）（例如，VWR，产品编号：1500-500）
庆大霉素50mg / ml（例如，Lonza，目录号：17-528Z）
来自牛胰脏的胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I1882-100MG）
胰蛋白酶（例如， Mediatech，目录号：25-054-CI）
来自
高级DMEM / F12（例如，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12634010）
牛血清白蛋白（BSA）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：A2153-100G）
来自牛胰腺的DNase I用于组织制剂（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D4263-1VL）
Pen / Strep（例如，，Sigma-Aldrich，目录号：PENNA-100MU和S6501-100G）
ITS液体培养基补充剂100x（Sigma-Aldrich，目录号：I3146-5ML）
Murine FGF-basic（PeproTech，目录号：450-33）
二甲基亚砜（DMSO）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D2650-5x10ML）
不含核酸酶的水（例如，Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，Supest TM，目录号：AM9937）
TaqMan逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：N8080234）
PowerUp SYBR Green Master Mix（Thermo Fischer Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：A25743）
氯仿，纯化（例如，Avantor Performance Materials，MACRON，目录号：4432-10）
异丙醇，分子生物学级（例如，Fisher Scientific，目录号：BP2618500）
胶原酶溶液（参见食谱）
BSA溶液（参见食谱）
DNase解决方案（见配方）
有机体培养基（10 ml，足够10孔）（参见食谱）
冷冻介质（参见食谱）
cDNA主混合物（参见食谱）
qPCR主混合（见配方）

设备

生物安全柜（例如，，NuAire）
解剖工具（例如，114.3mm剪刀，Sklar手术器械，目录号：98-104;镊子，Sklar手术器械，目录号：97-751，无菌解剖刀，例如，Sklar Surgical Instruments，目录号：06-3110）
细胞培养培养箱（例如，，Heracell i Copper CO 培养箱，Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heracell 150i和240i，目录号：50116050）
具有温度控制的振动器（例如，，Thomas Scientific，目录号：1222U12）
制造商：Benchmark Scientific，目录号：H1000-M。
离心机用于15和50ml管（例如，Eppendorf，型号：5804）
离心机用于具有冷却功能的1.5ml反应管（例如，Eppendorf，型号：5427R）
真空吸力
微量移液管（例如，Gilson，目录号：F167300，Thomas Scientific的目录号：1222N73）
相位显微镜（例如，尼康）
可选：Cryo-Safe Freeze控制器（例如，，SP Scienceware - Bel-Art产品 - H-B仪器，目录号：F18844-0000）
NanoDrop 2000紫外 - 可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM，目录号：ND-2000）
PCR机器（例如，Applied Biosystems Proflex Thermocycler，Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4484073）
qPCR机器（例如，Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR系统，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：4376600）
-80℃冷冻机（例如，，VWR，目录号：10160-728）
水浴（例如，，PolyScience，目录号：WB10A11B）
可选：液体N 2冷冻箱（例如，VWR，目录号：82017-934）
冰箱（4°C）

程序

反义寡核苷酸（ASO）的设计
1. 选择一个靶基因进行击倒。这里描述的方案特别适用于长非编码RNA，但蛋白编码转录物的敲除同样是可能的。
2. 设计与RNA序列相互补充的20-mers。通常，ASO被设计为与外显子互补，但在某些情况下，针对内含子的ASO也是有效的。为目标序列设计至少两个特定的ASO（100％序列同一性）以及一个负调控（例如，一个加扰的ASO控制），参见（Diermeier等人，2016））。建议最多使用十个独立的ASO进行新的目标，因为不是每个ASO都会导致有效的击倒。
3. 使用核苷酸BLAST（ https：//blast.ncbi.nlm。 nih.gov/Blast.cgi ），以确保ASO仅针对目标目标。严格性在这一步很重要 - 即使一个或两个不匹配可能会导致不想要的脱靶效果。
4. 用于敲除实验的ASOs携带经修饰的核苷酸以增加结合亲和力。在20个核苷酸中，用2'-O-甲氧基 - 乙基（MOE）修饰第一个和最后5个核苷酸。中间的10个核苷酸保持未修饰。在美国，可从Integrated DNA Technologies（IDT）订购MOE修改例如。
5. 抵达后，将无菌DPBS中的冻干ASO重新悬浮。工作库存浓度：200μM
6. 储存于4°C，短期储存（长达一周）和-20°C长期储存。等分试样以避免反复冻融循环。
小鼠乳腺肿瘤组织的制备
1. 按照当地法规安乐死乳腺肿瘤小鼠。
2. 将小鼠腹部侧向上切割板，用70％乙醇喷雾小鼠，转移到无菌细胞培养罩。从这里开始的所有步骤都将在无菌条件下进行。
3. 使用无菌解剖工具去除肿瘤，并将其置于5cm细胞培养皿中。在多发肿瘤的情况下，分别从每个肿瘤中制备组织细胞
4. 使用手术刀从肿瘤中去除坏死组织。一般来说，与周围的实体瘤相比，坏死组织更暗和更柔软。坏死组织通常可以作为大肿瘤中心的黑色液化组织发现（Morton和Houghton，2007）。
5. 可选：建议存储少部分肿瘤用于组织学分析。因此，使用手术刀仔细切开肿瘤的1/4。将肿瘤嵌入O.C.T.在塑料冷藏库中，储存在-80°C。
6. 用手术刀切割剩余的肿瘤组织，直到组织块直径约2-3毫米
7. 将肿瘤组织转移到含有25ml胶原酶溶液（配方1）的50ml管中
8. 在培养箱中以100rpm的速度在37℃下摇动包含肿瘤组织的胶原酶溶液37℃45分钟。暂停现在显得多云。过度消化会导致大量单细胞，应避免使用。
9. 预热DMEM / F12培养基和有机体培养基至RT。
10. 预先将装有无菌水的24孔细胞培养板（参见注释1和2）和75厘米 2细胞培养瓶预温至37℃。
11. 在冰上解冻Matrigel。
12. 离心管，胶原酶溶液在520 xg下于25℃下10分钟。
13. 使用连接到真空抽吸的巴斯德玻璃移液管吸出上清液，留下约1ml的介质在颗粒的顶部。
14. 重要提示：除非另有说明，否则所有塑料移液器和管道应在使用前立即用BSA溶液预先涂覆，以避免将有机物粘到塑料表面。
15. 使用预先包被的移液管吸头将颗粒重悬于10ml预热的DMEM / F12培养基中。
16. 将悬浮液转移到已经用BSA溶液预包被的15ml离心管中
17. 离心管在520 xg下于25℃下10分钟。
18. 如步骤B13所述吸出上清液。巴斯德移液器不需要在使用前用BSA预涂。
19. 使用预先包被的10ml移液管吸头，将沉淀重悬于4ml DNase溶液（配方3）中。
20. 用手轻轻晃动2-5分钟。
21. 加入6ml的DMEM / F12，并用预先包被的10ml移液管吸头彻底重新悬浮。
22. 通过细胞过滤器将悬浮液过滤到新鲜的预包被的15 ml管中，以去除胶原酶消化后残留的大块。
23. 离心管在520 xg下于25℃下10分钟。
24. 如步骤B13所述吸出上清液。巴斯德移液器不需要在使用前用BSA预涂。
25. 使用预先包被的移液管尖端将沉淀重悬于10ml的DMEM / F12培养基中
26. 脉冲离心管在25℃下加热至520×g。一旦达到520 x g，就停止离心机。
27. 重复步骤B25-B27三次（共四次），或直到脉冲离心后的培养基清晰。最后一步，小心删除整个介质。
28. 使用预先包被的移液管尖端将沉淀重悬于10ml的DMEM / F12培养基中
29. 确保悬浮液混合均匀。使用微量移液管取出50μl，转移到无菌的5cm细胞培养皿中，以确定溶液中有机物的密度。
30. 在显微镜下计数50μl的有机物数量。有机物被计入盘中，不需要盖玻片。准备后立即乳腺肿瘤组织的实例如图1所示。根据肿瘤的大小，每个制剂的总有机体含量可以从约5,000到40,000不等。当前实验不需要的有机体可以如步骤B42所述进行冻结和储存。
  
  图1.有机体的分子形态发生。在该实施例中，从MMTV-PyMT衍生的乳腺肿瘤制备组织细胞。左图：有机物在第0天，组织准备后，嵌入Matrigel。右图：在第6天的有机物，在FGF碱基存在下生长，嵌入Matrigel。
31. 离心管在520℃下在25℃下2分钟。
32. 使用巴斯德玻璃移液器，将上清液完全小心地吸出。巴斯德移液器不需要在使用前用BSA预涂。
33. 根据以下标准将Matrigel中的有机体颗粒重悬，立即放入冰中。由于Matrigel的高蛋白质含量，移液器吸头和细胞培养板不需要用BSA预包被该步骤。为了在24孔细胞培养板中培养有机物，需要每孔80μl。有机体电镀密度根据下游测定而变化。对于显微镜分析，板组织细胞密度为2个有机体/μl（见注2）。对于RNA提取，板组织细胞的密度为5个有机体/μl。一个井产生足够量的RNA以进行下游的qRT-PCR测定;如果需要更高的RNA产量，则在提取RNA时将两个或更多个孔进行接种（参见方法C：从有机体中提取RNA）。
34. 准备无菌预热（37℃）的24孔细胞培养板，并将其置于装有无菌水的预温热（37℃）75cm 2 / sup细胞培养瓶的顶部。充满水的烧瓶像加热板一样起作用，对Matrigel的快速固化至关重要
35. 小心地将含有基质胶的有机物质平铺在孔中部的80μl圆顶（见注1）。避免气泡。移液管吸头不需要用BSA进行预涂，可用于此步骤。
36. 将培养板在细胞培养箱中孵育5％CO 2和37℃20分钟。
37. 每孔加入1ml预热的（RT）有机介质（Recipe 4）。小心不要打扰Matrigel圆顶。
38. 在无菌条件下向培养基中加入反义寡核苷酸（ASO）。单独添加ASO，每井一个。最佳ASO浓度根据ASO和靶基因而变化。应执行0.1-5μM范围内的滴定（见注3）。作为起点，每孔5μM的浓度（25μl，200μMASO溶液）应该导致> 50％的大多数目标击倒。 ASOs由乳腺组织自由摄取，不需要转染试剂。
39. 至少留下一口井未经治疗，并用至少一口井将ASO（scASO）作为阴性对照。
40. 在5％CO 2和37℃的细胞培养箱中孵育有机物。
41. 将培养基更换为新鲜的有机体培养基，并在组织发生后三天补充ASO。有机体应在产后6天内收获（见附注4）。在FGF存在下培养6天的乳腺组织细胞的一个例子如图1所示
42. 可选：当前实验不需要任何额外的有机物，可以进行冷冻和储存。为了这样做，在步骤B30计算所需的有机物的量和有机体悬浮液的相应体积。将有机体悬浮液分成两部分，一个含有实验所需的量，另一个含有任何其他有机物。如步骤B31和B32所述进行两个等分试样。重新悬浮Matrigel实验所需的有机物，如上所述进行。将额外的有机物重新悬浮在冷冻介质（配方5）中，等分在冷冻机中，并转移到CryoSafe冷冻控制器。在-80℃下保存过夜，并在第二天转移到液体N 2。为了解冻有机体，将小瓶温至37℃，并将组织重悬于10ml的DMEM中。按照步骤B31至B37对Matrigel中的有机物进行平板化。对于解冻的有机物，推荐使用5-10种有机物/μl的种子密度，因为并非所有的有机体都能在冻融过程中生存。
从有机体中提取RNA
1. 可以在ASO加入后24小时收获有机物，以测定击倒效率。如果需要进行表型分析，可以在ASO加入后第3天6天（有机体制剂的第0天）进行活细胞成像，因为分支形态发生在3-4天左右开始。或者，可以在第6天进行端点显微镜分析，以比较ASO处理的有机体以控制有机体。在这种情况下，仍然可以在第6天测定击倒效率（见注4）
2. 将含有有机物的24孔板从细胞培养箱转移到冰箱（4℃）。这一步将导致Matrigel过夜液化。
3. 第二天，将每个孔（培养基和Matrigel）的内容物转移到冰上的15ml离心管中。
4. 向每个孔中加入200μl冷细胞回收溶液以解聚任何残留的Matrigel，并在4℃下孵育1小时。
5. 转移每个孔（细胞回收溶液和Matrigel）的内容物，并结合以前去除的有机体/ Matrigel混合物。如果Matrigel粘在底部，可以使用仔细的刮擦来分离Matrigel和有机物
6. 在冰上孵育1小时。
7. 在4℃下以420g离心10分钟。
8. 使用微量移液管仔细吸取上清液。
9. 将有机体沉淀重悬于100μl冷细胞回收溶液中
10. 在冰上孵育10分钟。
11. 在4℃下以420g离心5分钟。
12. 使用微量移液管小心吸取上清液。
13. 将沉淀重悬于1ml 1x DPBS（不含RNase）中。
14. 在4℃下以420g离心5分钟。
15. 使用微量移液管小心吸取上清液。
16. 将细胞沉淀重悬于1ml TRIzol中
17. 根据制造商的说明从有机体分离RNA。推荐添加糖原（如GlycoBlue），因为如果有机体以低密度接种并在24小时后收获，RNA产量可能很低。将RNA沉淀重悬于10-20μl无核酸酶的水中
cDNA合成和qPCR分析击倒效率
1. 使用NanoDrop 2000 UV-Vis分光光度计测量RNA浓度。始终保持RNA在冰上，以免降解。
2. 使用总共1,000 ng RNA，体积为8μl（浓度为125 ng RNA /μl）。如果浓度较高，则在无核酸酶的水中稀释。
3. 将样品转移到0.2 ml PCR管中
4. 通过向RNA样品中加入1μl10×DNase反应缓冲液和1μlDNA酶I（总体积：10μl），进行DNA酶消化去除任何潜在的共同纯化的基因组DNA。
5. 通过轻轻移液上下混合反应。在离心机中短暂旋转。
6. 在PCR机中在25℃下孵育反应15分钟
7. 加入1μl25 mM EDTA
8. 通过轻轻移液上下混合反应。在离心机中短暂旋转。
9. 在PCR循环仪中在65℃下反应10分钟
10. 在10分钟孵育完成后立即将样品转移到冰上。不要将样品放在PCR机中，同时倾斜到RT。
11. 准备cDNA主混合物（配方6）。
12. 在冰上将样品加入39μlcDNA Master混合物
13. 通过轻轻移液上下混合反应。在离心机中短暂旋转。
14. 在PCR机器中进行以下孵育：
  25°C 10分钟
  48°C 30分钟
  95°C 5分钟
15. cDNA可以短期储存在4°C或长期保存在-20°C
16. 准备包含靶基因引物的qPCR主混合物（配方7）（见附注5）以及含有内部对照（“家务”）基因引物的qPCR主混合物。在计算需要的主混合料量时，应考虑将样品一式三份移至。
17. 常用的内部控制基因包括β-肌动蛋白，GAPDH或核糖体蛋白基因。应仔细选择内部控制;其表达水平应与实验条件（如ASO治疗）一致和独立。内控基因的表达水平应与靶基因相同。关于qPCR实验和qPCR引物设计的一般规则可以在（Bustin等人，2009）中找到。
18. 在冰上准备96孔板。
19. 将2μlcDNA移入96孔板的一个孔中。每个样品将被移液一次三次，用于目标和持家基因（=每个样品含有2μlcDNA的6个孔）。
20. 将含有靶基因或内部对照基因引物的18μl主混合物加入孔中
21. 用光学胶粘剂膜密封96孔板。避免用手指触摸胶片，边缘小心处理。
22. 在室温下将板旋转100分钟1分钟。
23. 将板放在qPCR机器中，并运行以下程序：
  95℃10分钟
  40个循环：95℃15秒 60°C 60秒
  其次是
  熔体曲线95°C→60°C，1°C / min

数据分析

从qPCR机器导出Ct值，并使用2 -ΔΔCt方法（Livak和Schmittgen，2001）进行分析。与未经处理的样品相比，用ASO处理的样品中的靶基因应显着降低，而用scASO处理的样品作为阴性对照。 scASO不应对基因表达产生任何影响，并导致与未处理样品非常相似的值。非常有效的ASO可以产生＆gt; 90％的击倒效率，但击倒效率在不同的ASO和目标基因之间变化。应对至少三个独立的生物复制进行统计学上有意义的结果。通过增加使用的ASO的量，测试针对RNA的不同区域的ASOs和不同的有机体密度，可以提高不足的击倒效率。此外，电镀有机物时，ASO可以与Matrigel混合，并添加到介质中以获得最大的击倒效率。
可以使用标准光学显微镜进行有机体表型变化的端点分析。当比较ASO处理的有机体以控制有机体时，经常观察到数量，大小和分支形态发生的变化。为了进行统计学显着的比较，每次治疗应至少计算100个组织细胞，最少进行3次实验重复。

笔记

有机物也可以在48孔和96孔板中生长，用于需要更高产量的测定。 Matrigel穹顶的尺寸必须相应地缩小，例如，在48孔板中40μl/孔，在96孔板中20μl/孔。
如果要进行活细胞成像以分析有机体，请使用玻璃底板（例如，，MatTek）
如果使用新的未经测试的ASO，建议测试几种浓度（例如，，0.1,0.5,1和5μM），并比较击倒效率。
根据我们的RNA-seq数据，在人造细胞外基质（ECM）中培养长达七天的有机物不会显着改变lncRNA的表达模式（Diermeier等人，2016）。 br />
为了获得最佳结果，qPCR的引物不应与ASO结合位点重叠，并且ASO不应在qPCR扩增区内结合。

食谱

胶原酶溶液（50ml，足以用于两个肿瘤）
2 ml FBS
2.5μl庆大霉素（50mg / ml）
25μl胰岛素 4毫升胰蛋白酶
75毫克胶原酶
加入DMEM / F12至50 ml
无菌过滤器使用前
准备后立即使用
BSA溶液（2.5％）
将2.5mg BSA溶于100ml DPBS中无菌过滤器使用前
可以重新使用并在4℃下储存长达四周
DNase解决方案
从牛胰腺（1U /μl）中加入40μlDNase I至10ml DMEM / F12培养基准备后立即使用
有机体培养基（10 ml，足够10孔） 100μlPen / strep
100μlITS
3μlFGF-basic
加入DMEM / F12至10 ml
可以在4°C储存一周
没有添加FGF2，有机介质可以在4℃下储存长达四周
冷冻介质
FBS中的10％DMSO 可以长期保存在-20°C
cDNA主混合物（除了不含核酸酶的H 2 O 2之外的所有组分包括在TaqMan反转录试剂盒中）
10x TaqMan RT缓冲区
5μl
随机六进制文件
2.5μl
MgCl 2（25mM）
11μl
dNTPs
10μl
核糖核酸酶抑制剂＆nbsp;＆nbsp;
1μl
RTase
1.25μl
不含Nuclease的H 2 O /或
8.25μl
总量
39μl
准备后立即使用
qPCR主组合
PowerUp SYBR绿色主混音
10μl
不含Nuclease的H 2＆lt;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;
7μl
总计
17μl
底漆混合（用于+ rev，10μM）
1 /孔（浓度：0.5μM/孔）
准备后立即使用