材料和试剂

Materials
1. 移液器提示（美国科学）
2. 6厘米的组织培养板（USA Scientific，Cyto-One，目录号：CC7672-3359）
3. Cryovials（USA Scientific，目录号：1412-9100）
4. 1.5 ml Eppendorf管（USA Scientific）
5. PVDF膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620177）
6. 放射自显影片（Denville Scientific，目录号：E3012）
7. 6孔板
细胞
1. U4C细胞：这些细胞是从HT1080细胞产生的，并且缺乏IFN信号传递注意：这些细胞维持在含有10％FBS，100个国际青霉素单位，100μg/ ml链霉素（完全DMEM）的DMEM中。
2. P2.1细胞：这些细胞由U4C细胞产生，并且缺乏IRF3表达
  注意：这些细胞维持在含有10％FBS，100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素（完全DMEM）的DMEM中。
3. P2.1 / IRF3细胞：通过在P2.1细胞中稳定表达人IRF3产生这些细胞，并在嘌呤霉素（1μg/ ml）下选择
  注意：这些细胞维持在含有10％FBS，100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素和嘌呤霉素（1μg/ ml）的DMEM中。
4. LLC-MK2细胞（ATCC，目录号：CCL-7）：
  注意：这些细胞维持在含有10％FBS，100μg/ ml青霉素，100μg/ ml链霉素的培养基199中。
注意：U4C，P2.1和P2.1 / IRF3细胞在作者的实验室中产生并且在之前描述。请参阅Chattopadhyay等人，2010年和2016年。这些细胞系可根据要求从作者获得。
病毒
仙台病毒（SeV）Cantell菌株（Charles River实验室） - 该菌株最初从ATCC（ATCC，目录号：VR-907）获得
试剂
1. Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Lerner Research Institute Central Cell Services，目录编号：11-500p）
2. 胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11550）
3. 完全无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
4. 冷冻保护介质（Lonza，目录号：12-132A）
5. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lerner Research Institute Central Cell Services，目录号：123-1000p）
6. SDS-PAGE加载缓冲液（Laemelli）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610737）
7. 10x SDS-PAGE运行缓冲液（AMRESCO，目录号：0783）
8. 蛋白质测定染料（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
9. 10x传输缓冲区（AMRESCO，目录号：0307）
10. 脱脂奶粉（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404XTU）
11. 使用Tween-20（TBST）的Tris缓冲盐水（AMRESCO，目录号：K873）
12. 抗体
13. ECL plus溶液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：80196）
14. 培养基199（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11150059）
15. 琼脂（BD，Difco TM ，目录号：214050）
16. 豚鼠红细胞（科罗拉多血清公司，目录号：30100）
17. Tris缓冲液（pH 7.4）（Affymetrix，目录号：22639）
18. 5M氯化钠溶液（NaCl）（Affymetrix，USB，目录号：75888）
19. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
20. 原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508-10G）
21. 氟化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6521）
  注意：本产品已停产。
22. β-甘油磷酸二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：G9422）
23. 焦磷酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6422）
24. 细胞裂解缓冲液（参见食谱）

设备

微量移液管（10μl，200μl，1,000μl）（Eppendorf）
SDS-PAGE和转移装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini PROTEAN-II）
注意：制造商不再提供此设备（也可使用相同的琼脂糖凝胶机）。
涡旋（Thermo Fisher Scientific）
组织培养箱（37℃，5％CO 2）（Thermo Fisher Scientific）
生物安全柜（Baker SterilGARD）
台式离心机（Eppendorf）
加热块（95°C）（基准）
摇杆（基准）
旋转器（Labnet）
冰箱（4°C）和冷柜（-20°C和-80°C）
放射自显影胶片处理器（柯达）
分光光度计（基准）
液氮罐冷冻机CM2（D.A.I.科学仪器）

程序

用SeV感染P2.1细胞
1. 将500,000个P2.1细胞种植到6厘米的组织培养皿中（图2）
  
  图2.使用P2.1亲本细胞开发SeV持久性细胞系使用P2.1细胞系产生和维持SeV持续感染细胞的流程图。蛋白质印迹显示在不同通道数（由P表示）下病毒蛋白（SeV C）表达水平一致，肌动蛋白用作加载对照。
2. 细胞粘附后（接种后约16-18小时），检查80％汇合，用含有2％FBS（病毒感染培养基）的DMEM洗涤细胞两次，然后加入最少量（1ml）的病毒感染培养基。
3. 以80个凝血单位/ ml的浓度添加SeV。使用病毒孵育细胞1小时，每10分钟轻轻搅动身体
4. 取出含病毒的培养基，并用含有10％FBS的DMEM洗涤细胞两次。
5. 继续培养含有10％FBS的DMEM细胞，每3天传代细胞，放置10％用于检测SeV，50％用于冷冻。
6. 每次通过后，保留一些细胞用于将来的分析。
  1. 将含有10％FBS的DMEM中的0.5ml细胞悬浮液与0.5ml冷冻保护培养基结合在标记的冷冻管中。
  2. 立即放入保存在-80°C的冷藏库。
  3. 对于长期储存，将电池存放在液氮罐中
7. 为了确定病毒的存在，收集的细胞通过蛋白质印迹分析进行病毒蛋白检测，如下所述
SDS-PAGE和Western blot检测SeV感染
1. 种子P2.1细胞和SeV感染的P2.1细胞分成6厘米的组织培养皿
2. 24小时后或细胞汇合时，收获细胞裂解物。
3. 在20％SDS-PAGE凝胶上加载等量的蛋白质。
  注意：加载前，将细胞溶解产物与等体积的2x SDS-PAGE加载缓冲液组合。
4. 将蛋白质在100V电泳2小时，或直到达到10-100kDa区域中蛋白质的充分分离。
5. 使用Bio-Rad半干式转移装置在0.06 mA下将蛋白质转移到PVDF膜上1.5 h
6. 将TBST中含有5％脱脂乳的TBST在室温下封闭30分钟
7. 在阻塞缓冲液中加入1:5,000稀释的抗仙台病毒C抗体。在室温下在4℃下在摇床上孵育1小时或12-16小时。
8. 在TBST中洗涤膜三次，并加入次级（HRP缀合的）抗体，在封闭缓冲液中稀释至1:5000稀释，在室温下孵育1小时。
9. 在TBST中洗涤膜三次，并在ECL溶液中孵育1-3分钟
10. 使用放射自显影胶片处理器制作放射自显影胶片。
持续感染细胞中感染性病毒颗粒的定量
培养上清液中的感染性SeV滴度通过先前描述的方法（Peters等人，2008）测定，并以pfu / ml表示。简而言之，执行以下过程：
1. 种子LLC-MK2细胞在培养基199中每孔100,000细胞的6孔板中，并使细胞变得融合（大约三天）。
2. 来自持续感染的细胞系的培养物上清液被连续稀释，然后使用病毒感染方案（如方法A所述）用于感染融合的LLC-MK2单层。
3. 感染后，将细胞洗涤并用含有0.5％琼脂的培养基199覆盖
4. 3天后，除去琼脂层，细胞用PBS洗涤
5. 通过将单层与0.1％的豚鼠红细胞悬浮液孵育20-30分钟来显现病毒菌落。然后用PBS洗涤单层，计数血液吸收的噬菌斑。

数据分析

为了证实病毒持久性已经实现，可以进行一些相对简单的测定。仙台病毒表达非结构蛋白（C），也称为SeV C，可以通过Western印迹法检测持续感染的P2.1细胞，其方法在上一节中概述。为了证实存在，或者说，在P2.1细胞中SeV不存在，可以将抗SeV C抗体应用于Western印迹，如果阐明了约25kDa的条带，则可以确认持久性（图2）。

笔记

应仔细评估用于检测SeV C蛋白的蛋白质印迹，因为抗体还与具有相似大小的其他病毒和细胞蛋白质交叉反应。在20％SDS凝胶上仔细分离这些蛋白质将有助于分析（图3）

图3. SeV C蛋白表达的代表性Western印迹。当通过Western印迹分析细胞裂解物时，人类细胞模拟感染或用SeV感染16小时。 NS，非特异性。

食谱

细胞裂解缓冲液
50mM Tris缓冲液，pH 7.4 150 mM NaCl
0.1％Triton X-100
1mM原钒酸钠
10 mM氟化钠
10mMβ-甘油磷酸盐
5mM焦磷酸钠

致谢

我们的工作得到美国心脏协会科学家发展资助15SDG25090212（SC）和托莱多大学医学与生命科学学院启动基金（SC）的支持。该协议和一些代表性的结果是从我们以前的工作（Peters等人，2008）中改编而成。

参考

Chattopadhyay，S.，Fensterl，V.，Zhang，Y.，Veleeparambil，M.，Yamashita，M.and Sen，GC（2013）。＆nbsp; 干扰素调节因子3介导的细胞凋亡在仙台病毒持续感染的建立和维持中的作用。 87（1）：16-24。

Chattopadhyay，S.，Kuzmanovic，T.，Zhang，Y.，Wetzel，JL和Sen，GC（2016）。转录因子IRF-3的泛素化激活RIPA，保护小鼠免受病毒发病的凋亡途径。免疫性 44（5 ）：1151-1161。

Chattopadhyay，S.，Marques，JT，Yamashita，M.，Peters，KL，Smith，K.，Desai，A.，Williams，BR and Sen，GC（2010）。通过IRF-3介导的Bax激活诱导病毒凋亡。 29（10）：1762-1773。

Chattopadhyay，S.和Sen，GC（2017）。 RIG-I样受体诱导的IRF3介导的细胞凋亡途径（RIPA）：一种新的抗病毒途径。蛋白质细胞 8（3）：165-168。

Hiscott，J.（2007）。触发天生的抗病毒药物通过IRF-3激活的反应。 J Biol Chem 282（21）：15325-15329。

Peters，K.，Chattopadhyay，S. and Sen，GC（2008）。＆nbsp; 仙台病毒感染的IRF-3激活是细胞凋亡和避免持久性所必需的。 82（7）：3500-3508。