材料和试剂

Falcon ® 5 ml圆底聚苯乙烯试管（Corning，Falcon ®，目录号：352058）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水，不含钙，无镁（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：14200166）
Alexa Fluor大鼠抗磷酸组蛋白H3（pS28）（BD，BD Bioscience，目录号：558217）
柠檬酸钠（Na 3 C 6 H 5 O 7 / 2H 2 O））（Sigma-Aldrich，目录号：1613859）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
碘化丙啶（PI）（C 27 H 34 N 12 N 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
低渗裂解/ PI缓冲液（参见食谱）

设备

软件

程序

注意：所有程序都在室温下完成。

将悬浮细胞在0.4×10 6个细胞中的1ml DPBS中，在Falcon的5ml管中。
以200 x g离心5分钟。
吸引DPBS。
将细胞沉淀重新悬浮在100μl低渗缓冲液中，每个样品加入0.5μlAlexa Fluor 6470抗磷酸组蛋白H3（Alexa Fluor 647可在APC通道检测），然后轻轻混合样本。
注意：由于低渗休克消除了大部分RNA，因此不需要RNase治疗。
将管置于室温下，在流式细胞仪分析前至少20分钟，但不超过2小时。
注意：在测量之前包括额外的洗涤步骤不会改变结果，但可能导致细胞丢失。
通过流式细胞仪测量荧光（PI通道检测器585/40 nm，APC通道675/30 nm磷酸组蛋白H3染色）。收集至少20,000次事件，门禁残留碎片并测量二倍体和四倍体DNA峰（图1A-1D）。

图1.分析策略在分析HeLa细胞的细胞周期谱中的图示。A.通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）排除细胞碎片; B.通过前向散射宽度（FSC-W）和高度（FSC-H）排除团块和双峰; C.通过PI识别G 1，S和G 2 / M相; D.通过有丝分裂特异性抗体（磷酸组蛋白H3-APC）鉴定M期。每个相的细胞的最终百分比（％）约为G <1：61.6％，S：13.8％，G 2 / M：22.5，M：1.59％分析。

数据分析

如图1所示，DNA内容的直方图可以将细胞分为三组，G 1，S和G 2 / M / M期（图1C）。应用有丝分裂特异性抗体（磷酸组蛋白H3-APC）来区分M细胞的G 2亚（图1D）。

笔记

食谱

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院的R21AI117547和1R01AI114581，V-Foundation的V2014-001和美国癌症协会（R.W.）的128436-RSG-15-180-01-LIB的支持。

参考

Liu，L.，Lu，Y.，Martinez，J.，Bi，Y.，Lian，G.，Wang，T.，Milasta，S.，Wang，J.，Yang，M.，Liu， Green，DR和Wang，R。（2016）。促炎信号抑制增殖并将巨噬细胞代谢从Myc依赖性转移到HIF1α依赖性。 Proc Natl Acad Sci USA 113（6）：1564-1569。
Riccardi，C.和Nicoletti，I.（2006）。通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析细胞凋亡 Nat Protoc 1（3）：1458-1461。