材料和试剂

Falcon 15 ml锥形管（Corning，Falcon ®，目录号：352196）
BIO-BIK 1.5ml离心管（Ina-optika，目录号：CF-0150）
26号针（Terumo Medical，目录号：NN-2613S）
实验室擦拭（Kimwipes）（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：62011）
0.22μm过滤器（TPP Techno Plastic Products，目录号：99155）
10厘米组织培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：353046）
稳定表达荧光标记物（如绿色荧光蛋白（GFP））的多能干细胞用于检测注射细胞
注意：我们使用赤裸鼠（NMR）iPSC（克隆24和27），小鼠iPSC（克隆20D17和38C2：Okita等人，2007）和人iPSC（克隆201B7：Takahashi等人， 2007），如我们以前的研究（Miyawaki等人，2016）所述。
无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（NACALAI TESQUE，目录号：27575-31）
0.1％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15090046）
胎牛血清（Biowest，目录号：S1820-500）
Dulbecco改良的Eagle's培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
青霉素/链霉素（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-23191）
非必需氨基酸（NACALAI TESQUE，目录号：06344-56）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
L-谷氨酰胺（NACALAI TESQUE，目录号：04260-64）
DMEM / F12（Sigma-Aldrich，目录号：D6421）
KnockOut TM 血清置换（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10828028）
成纤维细胞生长因子2（PeproTech，目录号：100-18B）
异氟烷（Wako Pure Chemical Industries，目录号：099-06571）
70％乙醇
氨苄青霉素（Wako Pure Chemical Industries，目录号：012-23303）
多聚甲醛（Junsei Chemical，目录号：58295-1201）
氢氧化钠（NACALAI TESQUE，目录号：31511-05）
石蜡
苏木精和曙红（HE）
用于iPSC鼠标的iPS介质（参见配方1）
用于核磁共振和人类iPSCs的iPS介质（参见方法2）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方3）

设备

两个加湿的5％CO 2细胞培养箱：用于NMR iPSC的32℃，用于小鼠和人iPSC的37℃（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific＆amp; Heracell TM 150i）
离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：AX-501）
库尔特计数器（Beckman Coulter，目录号：6605698）
异氟烷蒸发器，腔室和鼻锥（Shinano，目录号：SN-487-0T）
加热垫（Nissin，型号：NHP-M30N）
操作剪刀和镊子（见图1）
25μlHamilton注射器（Hamilton，型号：702N，目录号：80400）
微量天平（Shimadzu，型号：ATX84）
冰箱

图1.本协议中使用的手术仪器

软件

GraphPad PRISM软件（GraphPad软件，型号：6.0版）

程序

准备移植细胞
1. 根据先前的报告（Takahashi和Yamanaka，2006; Takahashi等人，2007; Miyawaki等人，2016）保持iPSC。有必要准备至少2×10 6个单元格。
2. 在解离前1小时更换新鲜培养基
3. 吸出培养基，用PBS洗涤两次
4. 使用胰蛋白酶-EDTA（1ml / 10cm皿）分离细胞。
5. 停止与用于小鼠iPSC的15％胎牛血清培养基（见配方1）或用于NMR和人iPSC的胰蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶反应（参见方法2）。
6. 将细胞收集在15ml锥形管中，并将细胞重新悬浮在4ml PBS中
7. 使用库尔特计数器计数单元格。
8. 在室温下将细胞以200×g离心5分钟。
9. 吸出上清液并将iPSC再次悬浮在适当体积的PBS中，以终浓度至5×10 7细胞/ ml（等于1×10 6细胞/ 20 μl）
10. 将细胞转移到1.5ml管中
11. 将细胞置于冰上直至注射使用。
注射入小鼠
1. （可选）在手术前3天直到手术后1周，向小鼠口服氨苄青霉素含水（1 g / L）。
2. 将NOD / SCID小鼠放在加热垫上，用异氟烷麻醉
3. 用70％乙醇清洗手术区域，并从背部区域去除头发
4. 在注射腺顶部上方切开1厘米的切口并打开腹部。
5. 仔细拔出睾丸附睾脂肪垫（图2A）。
6. 用20μl（1×10 6个细胞）的细胞悬液填充汉密尔顿注射器。
7. 使用26号针切割睾丸阴道分泌物（图2B）
8. 使用汉密尔顿注射器注射20μl细胞悬浮液（图2C）
9. 慢慢取下针头以避免细胞回流。
10. 将睾丸返回原来的位置。
11. 缝合伤口。
注意：可以在视频1中查看注射过程的演示。

Video 1. Injection procedure. The cell suspension is blue stained for demonstration.
定义多能性和致瘤性
1. 移植后4,10,20或28周，按照“实验动物护理和使用指南”麻醉并处死小鼠。此后，解剖肿瘤和睾丸（图2D和2E）注意：分别注射小鼠iPSC和人iPSC后4周和10周可观察到肿瘤。
  
  图2.将iPSCs注射到NOD / SCID小鼠的睾丸中。移植手术（A-C）。畸胎瘤（D）和无肿瘤形成的睾丸的代表性照片（E）。箭头表示由小鼠iPSC形成的畸胎瘤。
2. 除去实验室擦拭物中的水分后，测量肿瘤的重量
3. 在含有4％PFA的PBS（见方案3）中将肿瘤或睾丸固定过夜，以便包埋在石蜡中。
4. 用苏木精和伊红（HE）进行染色切片，或进行免疫组织化学分析，检测GFP和分化标记物的表达。我们以前研究中的肿瘤和睾丸部分如图3所示（Miyawaki等人，2016）。
  
  图3.移植后iPSCs肿瘤和睾丸HE和免疫组织化学染色切片的图像。移植后10周，用iPSCs移植的小鼠的肿瘤和睾丸的HE染色切片（A和D），小鼠iPSCs移植后4周（B）或人iPSCs移植后10周（C）。 GFP（E）的免疫组织化学分析。箭头表示移植的GFP标记的NMR iPSC。刻度棒，200μm（A-C）和1cm（D和E）。

数据分析

对数变换（任意单位：6 + log2）分析肿瘤或睾丸的重量。巴特利特测试用于验证人口中的相等差异。实验组之间差异的统计学意义通过单因素方差分析或Kruskal Wallis检验确定，然后使用GraphPad Prism 6软件进行Dunn方法。当P 时考虑统计学意义0.05，并且所有数据以均匀±SEM显示，如Miyawaki等人，2016年。
我们以前的研究中肿瘤和睾丸的重量显示在表1中供参考（Miyawaki等人，2016）。

表1.每个畸胎瘤或睾丸的重量，平均体重

食谱

鼠标iPSC中等
Dulbecco改良的Eagle's培养基（Sigma-Aldrich）
15％胎牛血清（JRH或BioWest）
1％青霉素/链霉素（和光纯药）
2mM L-谷氨酰胺（NACALAI TESQUE）
0.1mM非必需氨基酸（NACALAI TESQUE）
0.1mMβ-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）
人重组白血病抑制因子（NACALAI TESQUE）
用0.22μm过滤器过滤，在4°C下储存
NMR和人类iPSCs培养基
DMEM / F12（Sigma-Aldrich）
20％KnockOut血清替代品（Thermo Fisher Scientific）
1％青霉素/链霉素（和光纯药）
2mM L-谷氨酰胺（NACALAI TESQUE）
0.1mM非必需氨基酸（NACALAI TESQUE）
0.1mMβ-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）
4ng / ml成纤维细胞生长因子2（PeproTech）
用0.22μm过滤器过滤，在4°C下储存
4％PFA
4克PFA
100毫升PBS
热板搅拌器加热
加入20μl1M氢氧化钠溶解残留的PFA 在-20°C下等分并冷冻保存注意：调查人员必须在准备PFA期间佩戴面罩，手套，实验衣和眼睛保护。

致谢

这项工作得到日本科技部PRESTO，日本教育，文化，体育科技部科学促进会科学研究资助基金的支持，创新型地区“氧气生物学科学研究资助计划”：从MEXT到KM和KM的综合了解生活的新标准和S.M.是日本科学促进会的研究员。

参考

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