材料和试剂

Kimwipe（1.5 x 2厘米）
塑料袋
手套
一次性圆形测试室，带有透明盖（直径13厘米，高10厘米）注意：视频跟踪需要透明盖。我购买了不透明的房间（B-313，东京加拉苏Kikai），并修改了盖子是透明的。然而，完全透明的室可以交替使用。
来自Charles River实验室的C57BL / 6J，14周龄
2,5-二氢-2,4,5-三甲基噻唑啉（TMT）（Contech，目录号：13267）
注意：Contech不再生产TMT。从其他厂商获取（例如ChemSpider，目录号：231591）。
80％乙醇
5％氢氧化铵

设备

电荷耦合器件（CCD）相机（Logicool，型号：HD WEBCAM C270）
通风柜（安全柜）
墙（纸板，30 x 35厘米）
皮皮特移液器（P10，Gilson）

软件

ImageFZ（ImageJ插件; Shoji等人），2014; http://www.mouse-phenotype.org/ ）
注意：虽然我在工作中使用过ImageFZ，但该软件仅支持旧的操作系统（Windows XP / 7和Mac OS 9）。为了与以后的Windows操作系统兼容，独立软件FreezeAnalyzerForAVI（ http://www.yuzaki-lab.org/publication/software ）可以作为替代（与Windows XP / 7 / 8.1 / 10兼容）

程序

注意：

尽管TMT不是有害物质，但它可能导致高浓度的刺激，因此应在通风橱中进行处理。
TMT是无色的，但具有明显的强烈的气味。因此，对于暴露条件不知情的实验者进行实验并不容易。然而，如果通风橱具有最小的开度并且没有TMT的泄漏，则可能以盲目的方式执行该实验。
应该使用性别和年龄匹配的同窝出生控制（性别，年龄，遗传背景和父母抚养可能影响动物行为）。
实验者应该选择单一或群体住房，因为笼子的数量可能会影响结果。我每笼保持2-4只小鼠（136 x 208 x 115毫米）。
在实验的所有程序之前24小时避免笼子更换。
基因型/治疗应该是盲目的，以避免实验者的偏见。

在TMT暴露之前的一天，在通风橱中处理所有动物两次，每次5分钟，以便将它们习惯于实验者和通风橱（视频1）。

Video 1. An example of mice handling in the fume hood
实验开始前至少30分钟，从实验室移动实验室的动物饲养笼。
注意：如果可能，实验动物笼应放置在实验室的隔壁房间，以尽量减少实验期间TMT渗漏的影响。
将一块Kimwipe（1.5 x 2厘米）粘贴到一次性圆形测试室墙壁的顶部边缘（图1A）。
将测试室放置在通风橱中，并将CCD相机放置在合适的位置，以便测试室保持在其视野内（图1B）。

图1. TMT诱导冷冻试验的设备。 A.一次性圆形试验箱和盖子; B.设备的放置。该房间被放置在围墙区域的中心，并在我的设备上以500勒克司灯照亮。
将每只老鼠轻轻地放入测试室，放在带通风口的透明盖子上，并用遮光罩关闭门，将实验者从鼠标中隐藏起来。开始视频捕获。这种"无气味"间隔持续5分钟，以记录基线的冻结水平。
打开门，使用Pipetman移液器将整齐的5μlTMT应用于Kimwipe。关上门，继续观察12分钟，监测TMT引起的冻结。
注意：注意避免TMT从通风橱到实验室的潜在泄漏。如果TMT溢出，应尽快用80％乙醇或5％氢氧化铵清除。
从测试室中取出鼠标，将其放入实验室旁边的临时储存室，以防止未经测试的小鼠被分析小鼠表面的TMT干扰。
更换新的试验箱，将密封在塑料袋中的试验箱密封并放在一个独立的房间（每个试验室仅使用一次）。
续订手套，重复步骤5.
当所有实验程序完成后，用80％乙醇或5％氢氧化铵擦拭通风橱，并丢弃所有实验设备，如纸板墙和测试室。

数据分析

冻结行为被定义为除呼吸以外的不动性，并且计算每个箱中总和的冻结持续时间的百分比。冷冻时间被认为反映了一定程度的恐惧。更长的冻结被解释为更大的恐惧。通过使用自动冻结分析软件（例如，例如，ImageFZ或FreezeAnalyzerForAVI）测量每只动物的冻结持续时间，或以盲人的方式手动测量。 2帧/秒的视频速率足以进行自动分析。野生型小鼠的代表性结果显示在视频2和图2中。使用双向重复测量方差分析（基因型/处理×1分钟时间仓）来确定统计学差异（Wallace等人， / em>，2000）

Video 2. An example of TMT-induced freezing. The mouse showed freezing behavior after the administration of TMT.

图2.野生型小鼠在TMT诱导的冷冻试验中的代表性结果。每个点代表六个雌性野生型（C57BL / 6J来自Charles River Laboratories，14周龄）的平均冻结持续时间的百分比。错误栏显示SEM。开始适应后，将小鼠暴露于TMT 5分钟。

致谢

该协议由Galliot等人修改（2012）。我感谢Michisuke Yuzaki博士的一贯支持。这项工作得到日本教育，文化，体育，科技部（MEXT）（16H06461给MY）的支持。

参考

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