材料和试剂

50毫升橡胶岭聚硫离心管，带螺帽（Thermo Fisher Scientific，目录号：3115-0050）
Eppendorf微管1.5 ml（VWR，目录号：700-5239）
PIPETMAN TIPS Diamond-ECOPACK TM D1000（Gilson，目录号：F161670）
PIPETMAN TIPS Diamond-ECOPACK TM D200（Gilson，目录号：F161930）
PIPETMAN TIPS Diamond-ECOPACK TM D10（Gilson，目录号：F161630）
不锈钢手术刀片（Swann Morton，目录号：0308）
啮齿动物大脑
注意：该方案仅用来自雄性年轻和成熟（3和12个月大的）Wistar大鼠和野生型，2型糖尿病和三重转基因阿尔茨海默病（3xTg-AD）的大脑测试，小鼠（11个月大）。尽管如此，我们认为，该方案可以应用于不同的品系，年龄和性别，尽管获得的样品量可能是限制因素。
冰
蒸馏水
异氟烷（Lab。Vitória，葡萄牙）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）
来自肠膜明串珠菌的右旋糖酐（Sigma-Aldrich，目录号：31398）
磷酸盐缓冲液（0.01 M）（见配方）
葡聚糖（16％）（见食谱）

设备

50ml Fisherbrand TM 可重复使用的玻璃低温格里芬烧杯（Fisher Scientific，目录号：FB10050）
骨切割钳（Aesculap，目录号：FO611R）
离心机（冷冻离心机）（Sigma Laborzentrifugen，型号：SIGMA 3-16K）
弯曲的精细镊子（Aesculap，目录号：FB401R）
Heidolph机械式塔顶搅拌器，Brinkmann（Heidolph Instruments，型号：RZR 1）
实验室瓶，窄口，带螺帽（VWR，目录号：215-1594）
微型PIPETMAN L（轻型）P200L（Gilson，目录号：FA10005）
Micropipette PIPETMAN L（Light）型P1000L（Gilson，目录号：FA10006）
镍/ SS实验室刮刀与1.63"扁圆头（Cole-Parmer，目录号：EW-06369-05）
培养皿盖60 x 15毫米（康宁，目录号：70165-60）
Potter-Elvehjem用PTFE杵和玻璃管（DWK Life Sciences，Kimble ®，目录号：886000-0023）
精密秤（Mettler-Toledo International，型号：AE240）
精密平衡PLE-N（KERN，型号：PLE-N）
手术刀（Aesculap，目录号：BB084R不锈钢）
软毛刷，3毫米直径。（CONTROLS，目录号：86-D1672）
摆动转子（Sigma Laborzentrifugen，目录号：11133）

程序

所有隔离方案步骤必须在4°C（始终保持冰上的溶液，匀浆和颗粒）下进行。

通过颈部置换（小鼠）和斩首（大鼠和小鼠）安乐死啮齿动物。所有程序均经实验动物科学协会联合会（FELASA）批准。
在头皮后方进行中线切口，沿头皮露出头骨（视频1）。

Video 1. Brain removal, dissection and homogenization
通过侧颅缝线将颅骨从颈部小心地切割到鼻子。可以在枕骨方向的枕孔中进行两次额外的切口，以方便进入大脑（图2A，视频1）。

图2.脑解剖和匀浆的说明图。通过侧面颅缝线（A）将颅骨从颈部小心地切割到鼻子。使用小铲（B）从头盖箱中取出完整的大脑。然后用精细夹层钳去除小脑，嗅球和白质，保持脑皮层（C）。最后，使用具有PTFE杵和玻璃管的Potter-Elvehjem，以800rpm / min（D），在4℃下，在4℃，在10ml PBS中均匀化脑组织。
使用小铲子从颅骨盒中取出完整的大脑（图2B，视频1）。
使用精细夹层钳去除小脑，嗅球和白质;保持脑皮层（图2C，视频1，见注1）
在非无菌PBS中进行快速洗涤（约30秒）（视频1;请参阅食谱）。
使用具有PTFE杵和玻璃管的Potter-Elvehjem，以800rpm / min（图3，视频1），在4℃，在4℃下，在4℃下均匀化新鲜脑组织。

图3.小鼠脑血管分离示意图
在720℃离心5分钟，4℃离心（图3）。
通过倾析弃去上清液（图3）
使用柔软的毛刷，3mm直径将沉淀重悬于10ml PBS中（图3）
再次重复步骤8-10两次。
将PBS重悬于沉淀超过20ml 16％葡聚糖的层（视频2;参见食谱）。
注意：必须轻轻地完成此步骤，以避免混合两层（图3）。

Video 2. Brain vessels isolation
以4,500 x g离心20分钟，4℃离心（图2）。
收集上清液和中间层，并将沉淀物保持在冰上（图3）
重复步骤14.
弃去上清液，将得到的两个沉淀重悬于100μlPBS中注意：将第一个沉淀重悬于100μlPBS中，并使用悬浮液重新悬浮第二颗粒。可以使用Mota和Ramalho-Santos（2006）所述的DiffQuick染色，在光学显微镜下观察血管（图4）。
将容器储存在-80°C直到使用（隔离后使用2年;图3）

图4. DiffQuik染色后分离的小鼠脑血管的代表性图像。在光学显微镜下观察到的未染色（A）和染色（B，C）脑血管。 100倍放大;比例尺= 50μM。

笔记

为了尽量减少可能偏向结果的日常变异性，在使用动物疾病模型的研究中，研究人员必须始终将血管与控制和患病动物模型隔离开。
分离脑血管所需动物的最小数量：1只大鼠脑或3只小鼠脑。然而，可以仅使用1只小鼠脑，颗粒尺寸将非常小，这将难以肉眼可视化。

食谱

磷酸盐缓冲液（0.01M）
8.5克/升NaCl
1.42g / L Na 2 HPO 4
pH = 7.4
葡聚糖（16％）
160克/升来自肠膜明串珠菌的葡聚糖

注意：

在制备溶液时必须使用1号蒸馏水。
在短时间内，解决方案必须在4°C（例如一周）内保存;对于更长的时间，溶液必须在-20°C（除葡聚糖溶液之外）保存。
不要冻结葡聚糖溶液;在4℃下稳定一周。

致谢

作者的工作得益于"FEDER基金通过运营计划竞争力因素 - COMPETE 2020"和FCT基金会在战略项目下的COMPETE归因参考：POCI-01-0145-FEDER-007440' 。克里斯蒂娜·卡瓦略（Cristina Carvalho）拥有FCT博士后研究奖学金（SFRH / BPD / 107741/2015）。手稿的作者没有声明利益冲突。该协议根据由McNeill等人（1999）描述的先前协议进行了修改。转载自"阿尔茨海默病杂志"，vol。 35，Carvalho，Cristina;马多多，努诺莫塔，保拉Correia，SóniaC.卡多索，苏珊娜; Santos，Renato X。桑托斯，玛丽亚。 Oliveira，Catarina R。 Moreira，Paula I.，Type 2 Diabetic and Alzheimer's Disease Mice Present Similar Behavioral，Cognitive and Vascular Anomalies，pp。623-635，版权所有（2013），经IOS出版社许可。

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