材料和试剂

10厘米培养皿（Greiner Bio One International，目录号：664160）
微量提示
15ml离心管（Greiner Bio One International，目录号：188271）
1.5ml微量离心管（Greiner Bio One International，目录号：616201）
3.5厘米圆形玻璃底盘（Cellview，Greiner Bio One International，目录号：627861）
血清移液管，10 ml（Greiner Bio One International，目录号：607180）
感兴趣的哺乳动物细胞系，这里：人皮肤成纤维细胞（见注1）
过氧化物酶体标志物（具有C末端过氧化物酶体靶向信号的荧光报告物，例如EGFP-SKL质粒[Schrader等人，2000]）
任选的：用于在哺乳动物细胞中沉默候选基因/蛋白质的siRNA，这里：ACBD5（Ambion，目录号：s40666）;控制加扰siRNA（GE Healthcare Dharmacon，目录号：D-001206-14-05）（50-100μM储备液）（在无菌的RNase /无DNA酶水或由制造商提供的缓冲液中）
70％（v / v）乙醇
TrypLE TM Express溶液（1x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12604013）（在4℃下储存）
浸油（Olympus，目录号：IMMOIL-F30CC）
用于人皮肤成纤维细胞细胞培养的完全生长培养基的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（4.5g / L）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11965092）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10082147）
青霉素/链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（K 2/2 HPO 4）
用于人皮肤成纤维细胞的细胞培养的完整生长培养基（参见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）（参见食谱）

设备

移液助剂（Greiner Bio One International，型号：Sapphire MAXIPETTE，目录号：847070）
II类生物安全柜/组织培养罩（更快，型号：SafeFAST Top 209-D，目录号：F00000050000）（见注2）
加湿的CO 2培养箱（95％空气，5％CO 2，37℃）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，superson TM，型号： Heracell TM 240i，目录号：510263330）
倒置光学显微镜（相位对比度）（ZEISS，型号：Primo Vert TM ）
37°C水浴（Grant仪器，型号：JBA12）
TC20 TM 自动细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，目录号：145-0101）
真空吸气系统（Fisher Scientific，目录号：11636620）
制造商：INTEGRA Biosciences，目录号：158320。
配备有用于15ml锥形管的摆动转子的台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific＆amp; TM），型号为Heraeus＆lt; Biofuge＆lt; sup> Stratos TM ，目录号：75005282）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Heraeus TM Pico TM，目录号：75002491）
Microporator Neon ®转染系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：MPK5000S）
旋转磁盘显微镜带有受控温度的CO 2室和客观温度计
注意：配备有横河电机CSUX1旋转盘（Yokogawa Electric，型号：CSU-X1）的Olympus IX81显微镜（Olympus，型号：IX81），CoolSNAP HQ2 CCD相机（Photometrics，型号：CoolSNAP HQ2）和UPlanSApo使用60x / 1.35石油物镜。使用最大20％的488nm固体激光器进行图像采集。强度。

软件

VisiView软件（Visitron Systems，德国）
斐济（ImageJ）
自定义Python数据分析管道

程序

细胞培养和转染
1. 在II类生物安全柜/组织培养罩中进行所有基于细胞培养的工作，并用70％（v / v）乙醇对工作表面和材料（例如，移液管）进行消毒。 >
2. 在加湿的CO 2培养箱（95％空气，95％空气中）培养完整生长培养基（参见食谱）（10cmØ细胞培养皿或细胞培养瓶）中选择的哺乳动物细胞（这里是人皮肤成纤维细胞） 5％CO 2，37℃）
3. 为了维持细胞，每2-3天刷新细胞培养基，并使用标准细胞培养程序在细胞达到100％汇合之前分裂细胞（见注3）。
4. 在转染前一天或两天，分裂细胞，使其在转染当天达到70-80％汇合（10cm×细胞培养皿或细胞培养瓶）。
5. 在转染前，准备3.5cm玻璃底层培养皿（不含抗生素），并在37℃的CO 2培养箱中预孵育。
6. 另外，将Neon ® Microporation设备放在生物安全柜中。用3ml电解液缓冲液E填充氖管，并将管插入移液器。在设备上设置转染参数（这里为1,700 V，20 msec脉冲宽度，1脉冲）（见注4和5）。
7. 对于转染，用1x PBS洗涤细胞（10厘米Ø细胞培养皿或细胞培养瓶）一次（参见食谱），并在37℃下用1ml TrypLE Express孵育2-5分钟。
8. 将分离的细胞重悬在9ml完全生长培养基（无抗生素）中，并使用TC20 自动细胞计数器（参见附注6）确定细胞数目。
9. 对于每个转染反应，使用1-2×10 5个细胞（10μl微孔尖端使用的细胞数）（参见附注7）。将所有转染的细胞总数转移到15ml管中，并在室温离心机（500×g）中离心3分钟。
10. 将细胞沉淀重悬于1ml 1x PBS中，并将细胞转移到1.5ml微量离心管中
11. 将微量离心机中的细胞以500×g离心3分钟，并将沉淀重新悬浮在缓冲液R中。缓冲液R的量将取决于所用转染次数和使用的微孔末端（例如< em，6，用10μl微孔尖端转染6×10μl=60μl）
12. 对于每次转染，在微量离心管中预先混合1-2μg质粒DNA（这里是EGFP-SKL）和50-100nM siRNA（任选的），并将10μl细胞重新悬浮于缓冲液R中。为了便于移液，在每个微量离心管中混合足够的试剂至少2次转染（见附注8）
13. 将10μl氖尖装入氖气移液管。
14. 将细胞浸入细胞DNA-siRNA混合物中并缓慢吸出10μl样品。避免在尖端产生气泡。
15. 将移液器插入移液器站中的E缓冲液管中，然后按触摸屏上的开始。
16. 电脉冲输送后，迅速从移液管中取出移液器，并立即将细胞从尖端转移到含有预热的生长培养基（不含抗生素）的3.5厘米培养皿中（见附注9）。
17. 轻轻地将餐具水平和垂直移动，以均匀分布细胞（见附注10）。
18. 将细胞在加湿的CO 2培养箱（95％空气，5％CO 2，37℃）中孵育48-72小时以允许有效的沉默（参见附注11 ）
19. 将适当的生物危险废物容器中的氖尖丢弃，并对剩余的细胞-DNA-siRNA混合物（例如，对照siRNA和感兴趣的其他质粒）重复步骤A12至A18（参见附注12）。
活细胞成像
1. 在图像采集之前，在显微镜阶段设置受控温度和CO 2室，以及客观的加热器。在不存在CO 2调节子的情况下，将细胞切换到CO 2 - 非依赖性介质（例如HEPES缓冲）。
2. 在受控温度和CO 2 2室内设置玻璃底盘，打开汞灯，扫描样品进行转染细胞（即绿色GFP信号）。
3. 使用VisiView软件进行图像采集。对于成像，从连续流中的每个细胞取出250个堆叠的9个平面（0.5μm厚度，100msec曝光）。所有条件和激光强度保持在实验之间。
4. 收集的图像使用VisiView转换为最大强度投影文件。此选项将每个堆叠中的图像压缩为单个图像，并以连续的时间范围（视频1和2）进行绑定。
  
  Video 1. Peroxisome movement in control fibroblasts. Video 1 shows movement of peroxisomes in human skin fibroblasts (control) transfected with the peroxisome marker EGFP-SKL (fluorescent reporter with a C-terminal peroxisomal targeting signal). Note the spherical, punctate labelling of peroxisomes and some long-range, directed movements, which are likely microtubule-dependent. Bar = 20 µm. Video 1 (2 min observation, 10 x original speed) is taken from Costello et al. (2017b).
  
  Video 2. Peroxisome movement in fibroblasts after loss of ACBD5. Video 2 shows increased movement of peroxisomes in human skin fibroblasts silenced for ACBD5. Peroxisomes were labelled as described (Video 1). Note that loss of ACBD5, which tethers peroxisomes to the ER, results in increased peroxisomal movement. Not all of the movements may depend on microtubules. Bar = 20 µm. Video 2 (2 min observation, 10 x original speed) is taken from Costello et al. (2017b).
过氧化物酶体动力学测定以下工作流被实现为一个Python模块，它使用Numpy，Scipy和Scikit-Image库。
1. 每个帧使用拉普拉斯高斯尺度空间滤波进行滤波（Lindeberg，1998）
2. 使用中间绝对偏差作为前景位置的鲁棒估计器来确定每个滤波图像的阈值（Hampel，1974）。
3. 过氧化物酶体位置被计算为超过阈值的过滤图像中的最大值
4. 使用使用Jonker-Volgenant算法的修改版本的全局优化子程序来跟踪帧之间的位置（Jonker和Volgenant，1987）。
5. 跟踪结果是手动验证的准确性。
6. 过氧化物酶体轨迹显示为轨迹和密度图，并转化为速度分布，随后将其绘制为累积分布函数（CDF）（图1）。
7. 跟踪的伪代码是：
  ＃检测
  allpositions = []
  for t in range（len（frames））：
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; filtered = scale_space_filter（frames [t]）
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; threshold = median（filtered）+ 3 * median_absolute_deviation（filters） > ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; position = peak_locations（filtered，mask = filtered＆gt; threshold）
  ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; allpositions.append（位置）
  
  ＃追踪
  allidentities = [range（len（allpositions [0]））]
  max_identity = max（allidentites [0]）
  for t in range（1，len（allpositions）+1）：
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; cost = distance_matrix（allpositions [t-1]，allpositions [t]）
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;身份，final_cost = lapjv（cost）
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;身份[final_cost＆gt; maximum_distance] = -1
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; max_identity = max（allidentites [-1]，max_identity）
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; num_new = count（identityities == -1）
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; identities [identityities == -1] = range（max_identity + 1，max_identity + num_new + 1 ）
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; allidentities.append（identity）
  
  ＃创建轨迹
  for t in range（len（allidentities））：
  ＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp;＆nbsp; for in in range（len（allidentities [t]））： />
  轨迹[allidentities [t] [i]]。append（allpositions [t] [i]）

数据分析

轨迹图（图1A-1C）
1. 对每个被分析的条件随机选择一个固定数量的过氧化物酶体轨迹 - 我们使用了100个轨迹。
2. 使用卡尔曼滤波和期望最大化算法的平滑轨迹（ https://github.com/ pykalman / pykalman ：PyKalman：用于Python的卡尔曼滤波器，平滑器和EM算法）
3. 绘制每个轨迹的初始20个时间帧，从中心（x = 0，y = 0），即开始，在绘制前从每个轨迹中减去初始位置（参见Costello et al。 al 。，2017b）。＆nbsp;
密度图（图1D-1F）
1. 选择所有重要的轨迹 - 在我们的例子中，我们选择了具有20个或更多时间帧的轨迹。
2. 使用卡尔曼滤波和期望最大化算法平滑轨迹。
3. 执行轨迹的x和y坐标的汇总和合并;我们在x和y方向上使用了-3.3μm的间隔，并且沿着每个维度使用了50个箱。
4. 绘制这些点的对数尺度的2D直方图以强调分布的“翅膀”;我们建议使用MatRlotlib（和MATLAB）中可用的“jet”颜色映射的高对比度色彩映射，例如。
ECDF图（图1G）
1. 选择所有重要的轨迹 - 在我们的例子中，我们选择了具有20个或更多时间帧的轨迹（参见Costello等人，，2017b）。
2. 使用卡尔曼滤波和期望最大化算法平滑轨迹。
3. 通过计算轨迹中每个时间点之间移动的距离来计算瞬时轨迹速度曲线。
4. 通过对速度进行排序，将速度转换成经验累积分布函数（ECDF）。
5. 通过在给定条件下汇总所有数据集的速度，为每个数据集生成单个ECDF（在我们的情况下，我们每个条件从24个视频中至少有38,175个轨迹）。
6. ECDF使用以下伪代码生成：
  xvals = sort（speed）
  yvals = range（N）/ N
  plot（xvals，yvals）
  
  图1.过氧化物酶体运动分析 A-C。对于轨迹图，为每个条件检索100个过氧化物酶体轨迹，并且从中心开始绘制前20个时间框架。 D-F。对于密度图，将所有轨迹≥20个时间帧的x和y坐标合并，并在x和y方向的间隔-3,3μm中采样，使用50个分箱。使用'jet'色彩图绘制这些点的对数刻度的2D直方图。 G.对于ECDF图，通过计算在轨迹中的每个时间点之间移动的距离来估计瞬时轨迹速度分布。将这些速度合并并转换为经验累积分布函数（ECDF）。通过汇总给定条件下所有数据集的速度，每个生成一个ECDF（从24个视频/条件中最少38,175个轨迹）。用于分析过氧化物酶体运动的所有三种方法显示，在涉及过氧化物酶体连接到ER的ACDB5被丢失的条件下，过氧化物酶体运动的增加。图1取自Costello等人。（2017b）。

笔记

也可以使用其它哺乳动物细胞系（例如COS-7或HepG2细胞）。那些不一定需要用于转染质粒或siRNA的微孔。
遵循贵机构的生物安全和转基因生物指导方针。
我们通常预热1x PBS，TrypLE TM Express溶液，并将成长培养基完成至37°C。通过真空抽吸用巴斯德吸管从培养皿中取出培养基。在加入TryplExpress溶液（约1ml / 10cm皿）（轻轻倾斜以覆盖表面并在37℃下孵育2-5分钟）之前，用3-4ml 1x PBS洗涤细胞一次。分离后，将细胞在完全生长培养基（10ml / 10cm皿）中收获，通过将细胞悬液移液2-3次上下移液小心地重新悬浮并转移到15ml锥形管中。通过在台式离心机（500×g，在室温下3分钟）离心将细胞沉淀并重新悬浮于10ml完全生长培养基中。对于维护，约将5×10 5个细胞转移到含有10ml完全生长培养基的新的10cm细胞培养皿中，并在加湿的CO 2培养箱（95％空气，5 ％CO 2，37℃）。
有关如何使用Neon ®设备的详细说明手册可以在供应商的网站上找到（ http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/neon_device_man.pdf ）。

需要优化其他细胞类型的转染条件。更多信息请参见供应商网站（ https://www.thermofisher.com/be/en/home/life-science/cell - 文化/转染/转染---选择杂志/霓虹灯转染系统/ neon-protocols-cell-line-data.html ）。

也可以使用Neubauer腔室手动确定细胞数目，例如。

建议收集比每次转染所需数量更多的细胞（例如，，双倍的量）以考虑由于电穿孔尖端中的气泡（可见放电）引起的可能的微孔破坏，并促进霓虹笔尖移液。

如果转染多于一个质粒，则预先混合1-2μg每个质粒。

在电火花的情况下，用细胞丢弃尖端，并使用备用电池重复微孔。

不要旋转，以避免细胞在盘中心积聚。

在运动分析之前，应通过设置类似的菜肴来测试和优化沉默效率，并进行细胞裂解和Western印迹。免疫荧光也可以确认有效的沉默

氖管吸头和管可以再生和重新使用，以最大程度地降低微孔成本（Brees and Fransen，2014）。

食谱

用于人皮肤成纤维细胞的细胞培养的完全生长培养基
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（4.5g / L），补充：
10％胎牛血清（FBS）
100 U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素储存于4°C
磷酸缓冲盐水（1x PBS）
140 mM NaCl
2.5 mM KCl
6.5mM Na 2 HPO 4
1.5mM K 2 HPO 4，pH 7.35

致谢

我们要感谢J. Costello和T. Schrader的有用的意见和建议。该协议由Costello等人改编。（2017b）J Cell Biol 216（2）：331-342。 DOI：10.1083 / jcb.201607055。这项工作得到了生物技术和生物科学研究理事会（BB / K006231 / 1和BB / N01541X / 1至M. Schrader）的资助。 J. Metz和M. Schrader由Wellcome Trust机构战略支持奖（WT097835MF和WT105618MA）支持。 M. Schrader由Marie Curie初步培训网络Action PerFuMe（316723）支持。