材料和试剂

吸取10μl，200μl和1,000μl（Labcon，目录号：1161-965,1065-960,1168-960）的提示
15毫升锥形离心管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：1332-015S）
2毫升微管（SARSTEDT，目录号：72.695.500）
铝箔（三菱铝，0.012mm厚）
96孔微孔板，未处理表面（Asahi Glass，目录号：1860-096）
微孔板密封（qPCR密封）（4份，目录号：4ti-0560）
Parachlorella kessleri （国家环境研究所，目录号：NIES-2152）
TAP培养基（不含琼脂;见 http：//mcc.nies.go .jp / 02medium.html ）
次氯酸钠（有效氯，最少5.0％）（和光纯药公司，目录号：197-02206）
玻璃珠，酸洗425-600微米（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
乙醇（99.5％v / v）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00456）
过氧二硫酸钾（K 2 O 2 S 2 O 8）（Kishida Chemical，目录号：310-63931）
酒石酸锑钾三水合物（C 8 H 4 H 2 O 2 O 12 Sb 2 O 3 ·3H 2 O）（Alfa Aesar，目录号：A13766）
L-抗坏血酸（和光纯药，目录号：012-04802）
四水合七钼酸铵（（NH 4））6 Mo 7 O 24 H 4·4H 2 / > O）（和光纯药，目录号：016-06902）
磷酸盐离子标准溶液（NaH 2 PO 4水溶液）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：168-17461）
硫酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-04706）
钼酸铵四水合物溶液（见配方）

设备

微铲（AS ONE，目录号：6-524-06）
移液管10μl，200μl和1,000μl（Eppendorf，型号：Research ®）
Microtube搅拌机（TOMY SEIKO，型号：MT-360）
高压灭菌器（TOMY SEIKO，型号：LSX-300）
离心机，摆动转子（TOMY SEIKO，型号：LC-121）
冷冻微量离心机（TOMY SEIKO，型号：MX-300）
酶标仪（BioTek Instruments，型号：EPOCH）

程序

注意：从采样到钼蓝反应的概述见图1。

图1.小球藻中的磷酸盐测定的概述 + S，充满硫的培养基（对照培养）; -S，贫硫的培养基（实验培养;详见Ota等人，2016）。

采样和制备藻类样品
1. 在15ml锥形离心管中，在TAP培养基（Ota等人，2016）中取10毫升藻类培养物[OD 595 ：1-2）。用摆动转子在室温下以2,500×g离心5分钟。丢弃上清液。此时，应采取额外的样品进行干重和/或细胞数量测量（参见下面的数据分析）。
2. 用2ml蒸馏水重悬沉淀并转移到新的2ml微量管中。悬浮样品可以分成两半：多聚-P测定1ml，总P测定1ml。
3. 在2,500 x g下，在室温下再次离心5分钟。丢弃上清液。此时，颗粒可以储存在-20°C的冰箱中进一步分析。
聚P的提取
1. 加入1ml＆gt; 5％次氯酸钠至细胞沉淀。
2. 加入2-3微玻璃珠（约50毫克），并在4℃下在冷室中使用微管混合器剧烈混合10-15分钟。在4℃下以14,000xg离心2分钟离心。去除上清液。
3. 将1ml次氯酸钠加入细胞沉淀。在4℃下以14,000xg离心2分钟离心。去除上清液。重复步骤3.
  注意：多磷酸盐的高链长度几乎不溶于碱性次氯酸钠（Sutherland和Wilkinson，1971）。
4. 加入100μl蒸馏水，室温孵育5 min。在4℃下以14,000xg离心2分钟离心。收集上清液（a）。
5. 加入100μl蒸馏水，孵育5 min。在4℃下以14,000xg离心2分钟离心。收集上清液（b）。
6. 向上清液（a + b）中加入1.8ml乙醇，并在4℃以14,000×g离心10分钟。在此步骤中，poly-Ps在试管底部以白色颗粒沉淀
7. 小心取出上清液，加入500μl蒸馏水，并剧烈混合（poly-P溶液）。
  注意：蒸馏水的量可以调节为50至500μl（OD 880> 0.3;参见下面的数据分析）。
8. 向聚P溶液中加入100μl4％（w / v）过硫酸钾。
9. 为了水解成正磷酸盐，在121℃高压灭菌20分钟，无需快速排气选项，以避免样品损失。高压灭菌时，盖上盖子并用铝箔盖住微管
10. 高压灭菌的样品现在可以用于钼蓝测定（见程序D）。
总P的提取
1. 用A3蒸馏水重悬细胞沉淀。
2. 破坏样品加入2-3个玻璃珠微珠，并使用微管混合器在4℃下在冷藏室中剧烈混合10-15分钟。
3. 向样品中加入200μl4％（w / v）过硫酸钾。
4. 在121℃高压灭菌20分钟，不用快速排气，以避免样品损失。高压灭菌时，盖上盖子并用铝箔盖住微管。
5. 高压灭菌的样品现在可以用于钼蓝测定（参见方法D）。
  注意：将上清液用于测定。通常，不需要离心步骤。
在96孔微孔板中进行钼蓝反应
1. 移取200μl稀释样品（196μl蒸馏水+ 4μlPoly-P / total-P样品）。
2. 加入8μl钼酸铵四水合物溶液（见下面的配方）
3. 加入2μl7.2％（w / v）L-抗坏血酸溶液
4. 用板密封膜密封并充分混合（倒置板3-5次）
5. 在室温下在黑暗中孵育20分钟。如果存在正磷酸盐，混合物会变成蓝色（图2）
  
  图2.在96孔微孔板中的钼蓝反应。这是磷酸盐离子标准稀释系列（从左到右为0,0.5,1,2 mg / L，n = 3）的例子。
6. 使用酶标仪测量880nm处的吸光度（OD 880）。
  注意：如果880 nm波长不可用，请选择880 nm附近的其他波长。

数据分析

在每个实验中需要校准曲线来计算相应的绝对值。用0至2mg / L（例如，0,0.1,0.5,1,2mg / L）的蒸馏水稀释磷酸盐离子标准溶液，其中吸光度（OD _{880 ），并确认Pi浓度（图3）。在每个孔的一个点测量OD 880 ，并且从每个样品至少三次重复计算平均值（3）。计算实例如下：聚-P提取中的浓度分别为5倍（程序A），1,000 /（100 + 500）倍（程序B）和4/200倍（程序D））。然后，如下计算聚-P浓度（mg / l）：相应值= {（OD 880 <0.05）/0.13}×1/5×600 / 1,000×200/4。当采样培养物时，应测量干重和/或细胞数量进行归一化。这些值用于计算每个干重或细胞的Pi量。

图3.校准曲线示例}

笔记

磷酸盐离子标准溶液可以使用磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）4自身产生。
所有储备溶液（过硫酸钾，四水合钼酸铵，L-抗坏血酸）均应用蒸馏水制备（见下面的配方）。
解决方案在使用时准备就绪。库存解决方案可以在4°C下储存一个月。
如果OD 880 <0.3以上，样品应用蒸馏水稀释

食谱

钼酸铵四水合物溶液（100ml）
1.2g七钼酸六铵四水合物
4.8毫克酒石酸锑醇钾倍半水合物
32ml稀硫酸（硫酸：蒸馏水= 1：1）用蒸馏水补足量

致谢

这项研究得到了日本科学技术厅（JST）的CREST计划（SK）提供的资助。

参考

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Ota，S.，Yoshihara，M.，Yamazaki，T.，Takeshita，T.，Hirata，A.，Konomi，M.，Oshima，K.，Hattori，M.，Bisova，K.，Zachleder， Kawano，S。（2016）。解密关系磷酸盐动力学，电子密集体和绿藻中的脂质积累。 6：25731.
Solovchenko，A.，Verschoor，AM，Jablonowski，ND和Nedbal，L。（2016）。从废水到作物的磷：一种涉及微藻的替代途径。生物技术Adv。34（5）：550-564。
Sutherland，IW和Wilkinson，JF（1971）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="https://books.google.com.hk/books?id=0qH9MgVTQ5EC&pg=PA346&lpg=PA346&dq=Chemical+extraction +微生物+细胞的+方法+和+微生物+细胞的方法+＆+ = + =微量％ >微生物细胞的化学提取方法 In：Norris，JR and Ribbons，DW（Eds。）。微生物学方法。卷。 5B。学术出版社 pp：1-665。