材料和试剂

Kit SMART cDNA（BD Biosciences，目录号：PT3041-1）
Sfi I限制酶
pDNR-LIB（BD Biosciences，目录号：PT3508-5）
喷气吸嘴套件（Genomed）
大肠杆菌 XLI蓝细胞
野生型细菌或缺乏3'→5'外核糖核酸酶的细菌（参见参考文献1）
苯酚（MP）氯仿（Merck KGaA）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs）
ATP（Promega Corporation）
Powerscript逆转录酶
乙醇
氯化钾
LB培养基
缓冲区1（请参阅配方）
缓冲液2（见配方）

设备

Beckman离心机
JA20转子

程序

RNA提取
1. 细菌在LB培养基中生长。
2. 在OD 650 = 0.4时，将10ml等分试样与等体积的在-70℃下预平衡的100％乙醇迅速混合。
3. 在Beckman离心机的JA20转子中在4,300×g和4℃下将细胞沉淀10分钟。
4. 将细胞重悬于1.5ml 4℃预平衡缓冲液1中。
5. 与在95℃预热的1.5ml缓冲液2裂解缓冲液混合。
6. 将细胞在95℃下裂解2分钟。
7. RNA在65℃下用3ml用水饱和的苯酚提取两次。
8. 在室温下用氯仿萃取RNA一次。
9. 然后在0.3M NaCl存在下用2.5体积的乙醇沉淀RNA，用70％乙醇洗涤，并溶于水中。
10. 使用Nanovue测定RNA浓度
RT-PCR
1. 1μg总RNA与10pmol CDSIII/3'PCR（5'-ATTCTAGA GGCCGAGGCGGCC GACATG-d（T）30NN-3'）和10pmol的寡聚SMART IV（5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT GGCCATTACGG GGG-3'）寡核苷酸（试剂盒SMART cDNA，BD Biosciences）。
2. 在72℃孵育2分钟，然后在冰中孵育2分钟。
3. 在来自供应商的2mM DTT，2mM dNTP，1x缓冲液中加入10单位PowerScript逆转录酶）。
4. 在42°C孵育1小时
5. 用20pmol 5'PCR引物（5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'），20pmol CDSIII/3'PCR寡核苷酸，0.2mM dNTP，2μlAvantage 2聚合酶混合物1x扩增cDNA。在92℃孵育1分钟，然后进行22个循环（95℃15秒，68℃6分钟）。
6. PCR产物在琼脂糖1％上分析，如果需要，根据它们的大小纯化
克隆和测序
1. 用200单位Sfi I在37℃消化cDNA 3小时。
2. 用30单位Sfi I在37℃消化pDNR-LIB质粒3小时。
3. 在琼脂糖凝胶上纯化线性质粒，并使用Jetsorb试剂盒洗脱DNA。
4. 沉淀cDNA和质粒，并重悬于水中。
5. 用600单位T4 DNA连接酶，1mM ATP，在推荐的缓冲液中在16℃下24小时监测cDNA和线性质粒。
6. 用5μl连接混合物转化150μl超感受态大肠杆菌 XLI Blue。

食谱

缓冲区1
10mM Tris-HCl（pH7.3）
10mM氯化钾 5mM氯化镁缓冲液
缓冲2
20mM Tris-HCl（pH7.9） 200 mM NaCl
40mM EDTA
1％SDS

致谢

这项工作得到了巴黎狄德罗大学国家科学研究中心（UPR9073;现在的FRE3630）和来自法国国家的"卓越倡议"计划（Grant"DYNAMO"，ANR-11-LABX-0011 ）。该协议最初出版于Maes等人（2012）。

参考文献

BD SMART ^TM PCR cDNA合成试剂盒用户手册。
Maes，A.，Gracia，C.，Hajnsdorf，E。和Regnier，P。（2012）。在 E中搜索poly（A）聚合酶靶标。大肠杆菌揭示其在Glu tRNA加工和稳定RNA降解的监测中的意义。 83（2）：436-451。