材料和试剂

气溶胶移液管吸头
20μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：21-402-551）
200μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-682-255）
1000μl移液器吸头吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：21-402-582）
具有斜颈的T225厘米烧瓶（Corning，Costar ®，目录号：3001）
显微镜幻灯片（超级清洁）（Scientific Device Laboratory，目录号：022）
无菌12毫米圆未经处理的护目镜;厚度0.13-0.17mm（Carolina Biological Supply，目录号：633029）
50ml圆锥管
24孔细胞培养板（Corning，Costar ®，目录号：3524）
感兴趣的细胞系（人呼吸上皮A549细胞[ATCC，目录号：CCL-185]）
重组野生型RSV（A2株，GenBank KT992094）（具有已知病毒滴度的病毒库，参见注释）
TryLE选择在室温下储存的细胞解离试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：12563）
牛血清白蛋白（BSA）标准品（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：23210）
抗RSV F蛋白小鼠单克隆抗体（mAb）（Abcam，目录号：ab43812）
抗β-微管蛋白（9F3）兔mAb（Cell Signaling Technology，目录号：2128）
山羊抗小鼠Alexa Fluor 488（AF488）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A11029）
山羊抗兔IgG-Atto 647N（Sigma-Aldrich，目录号：40839）
罗丹明鬼笔环肽（CYTOSKELETON，目录号：PHDR1）
ProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：P36930）
由多聚甲醛（PFA）制备的超纯甲醇游离甲醛16％溶液，EM级（Polysciences，目录号：18814）
F-12无添加剂的介质，以Ham's F-12营养组合（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11765054）商业销售
胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，HyClone TM，目录号：SH30071.03）
L-谷氨酰胺200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030081）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190）
Triton X-100（BioUltra，在H 2 O中约10％，Sigma-Aldrich，目录号：93443）
台盼蓝0.4％溶液（Lonza，目录号：17-942E）
F-12完整培养基（见食谱）
4％PFA（见配方）
0.05％Triton X-100（参见食谱）
3％BSA（参见食谱）

设备

移液器（Mettler-Toledo，RAININ，型号：Pipet-Lite XLS）
加湿的CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific＆amp;＆lt; sup＆gt;，型号：Forma＆lt; sup＆gt;＆lt; Steri-Cult＆lt;
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra 25R）
Leica TCS SP8 STED 3X系统（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP8 STED 3X）配备：
1. 白光激发激光器
2. 592 nm，600 nm，775 nm耗尽激光器
3. HC PL APO 100x / 1.40油STED白色物镜
4. 门式HyD混合式探测器
血细胞计数器（Marienfeld-Superior，目录号：0680030）
杜蒙NOC镊子（电子显微镜科学，目录号：0103-NOC-PO-1）

软件

使用LAS X软件（版本3.1.1.15751）（Leica Microsystems）
获取图像
使用惠更斯反卷积软件（Huygens Essentials版本16.10.1.p3，Scientific Volume Imaging BV，Hilversum，荷兰）对图像进行去卷积
PRISM软件版本7

程序

病毒感染
1. 按照ATCC的培养建议，维持T225烧瓶中的A549细胞，并进行以下修改：
  1. 使用F-12完整培养基维持生产线（参见食谱）;使用TrypLE选择细胞分离试剂;使用FBS禁用TrypLE选择。
  2. 为了将A549细胞种在盖玻片上，从含有约80％汇合的A459细胞的单层的T225烧瓶中除去F12完全细胞培养基。用10ml预热（37℃）1x DPBS轻轻冲洗单层，并除去DPBS。
  3. 为了解离细胞，加入5ml TryLE Select细胞解离试剂，并在37℃下在标准加湿的CO 2培养箱中孵育5分钟。通过加入10ml冷FBS灭活TrypLE选择。通过轻轻移液分离和解离A549细胞，并将单细胞悬浮液转移到50ml锥形管中。
  4. 通过在桌面离心机中在4℃下以300×g离心5分钟来将细胞造粒。将细胞沉淀重悬在10ml预热（37℃）F-12完全培养基中。稀释10μl重悬的A549细胞1:10在含有0.04％台盼蓝的DPBS中（80μlDPBS，10μl台盼蓝[0.4％]，10μl等份的A549细胞，重悬于完全F-12培养基中），并确定使用制造商推荐的血细胞计数器，每ml重悬细胞的浓度。
  5. 用50ml F-12完全培养基至3×10 4个/ ml细胞/ ml的50ml锥形管稀释重悬的A549细胞，通过加入1ml具有3×10 4 细胞到含有盖玻片的24孔板的每个孔中
  6. 在37℃，5％CO 2的细胞培养箱中孵育细胞一夜。
2. 为了感染A549细胞，用不含添加剂的150μlF-12培养基代替培养基，其中含有蔗糖纯化的RSV（Collins等人，1995和Le Nouen等人）。，2009;见注释），每个细胞1个噬菌斑形成单位（PFU）的感染复数（MOI）（见注释）。
3. 在37℃的CO 2培养箱中，用病毒接种物孵育A549细胞1小时。
4. 去除病毒接种物，并用1ml F-12培养基洗涤感染细胞2×，无添加剂。
5. 将感染的细胞在含有2％FBS和1％L-谷氨酰胺的1ml F-12培养基中在37℃下在CO 2培养箱中孵育24小时。
幻灯片准备
1. 取出细胞培养基，用1ml DPBS洗涤3次
2. 为了固定受感染的细胞，在室温下，用1ml新鲜制备的1：4稀释度的PFA（4％终浓度）在DPBS中孵育细胞30分钟。
3. 取出PFA溶液，每孔用1ml DPBS洗涤3次
4. 为了透化固定的细胞，在室温下用DPBS中的1ml 0.05％Triton X-100孵育10分钟。
5. 取出Triton X-100溶液，每孔用1ml DPBS洗涤3次
6. 为了阻止非特异性蛋白质结合，用PBS中的1ml 3％BSA在4℃孵育盖玻片3小时。
7. 用1ml DPBS洗涤细胞1×。
8. 在含有0.1％BSA的PBS中，在4℃孵育细胞过夜，使用一抗抗体混合物：小鼠抗RSV F mAb（1:500）和兔抗微管蛋白mAb（1:100）。
9. 洗涤细胞3次，每次1ml DPBS。
10. 在含有0.1％BSA的DPBS中，在4℃下在黑暗中孵育具有二抗混合物的细胞：山羊抗小鼠AF488（1:200）和山羊抗兔Atto 647N（1:100）3小时。
11. 洗涤细胞3次，每次1ml DPBS。
12. 对于肌动蛋白细胞骨架染色，在DPBS中将罗丹明鬼笔环肽（1：500）细胞在4℃黑暗中孵育30分钟。
13. 洗涤细胞2 x每个1 ml DPBS。
14. 用1ml去离子H 2 O 2洗涤2×2个细胞。
15. 要将盖玻片安装在玻璃片上，首先将10μlProLong Gold Antifade安装介质放在玻璃片上。用Dumont #NO镊子取下盖玻片，将盖板单元向下放到安装介质上，注意避免吸入气泡。
16. 在黑暗中干燥过夜。
成像程序
1. 在图1中，使用600Hz的双向扫描速度将所有图像收集在具有30nm像素尺寸的单焦点平面中。
  
  图1. RSV病毒颗粒沿丝状伪足的STED成像 A549细胞用RSV（MOI = 1PFU /细胞）感染24小时。细胞用RSV F（绿色）的抗体固定，透化和免疫染色;细胞微管蛋白网络通过染色β微管蛋白（青色）而显现。用罗丹明鬼笔环肽进一步染色这些细胞以检测F-肌动蛋白（红色）。如成像过程中所述，将所有图像收集在单个焦平面上。对于共焦图像采集（左图），用于检测RSV F（AF488），F-肌动蛋白（罗丹明鬼笔环肽）和微管蛋白（Atto 647N）的激发波长分别为488nm，561nm和647nm。随后的STED采集（中图）按以下顺序进行：首先，用于微管蛋白免疫染色的Atto 647N缀合物用647nm激发并耗尽775nm;然后，为了可视化F-肌动蛋白，罗丹明鬼笔环肽用561nm激发并耗尽660nm;最后，用于RSV F特异性免疫染色的AF488缀合物用488nm激发并耗尽592nm。 Filopodia（左下角的箭头指示）似乎将RSV颗粒穿过邻近的小区（在左下角的图像中用*标记）。所有通道的分辨率的增加是显而易见的STED成像，可以通过使用惠更斯软件（STED decon，右图）的去卷积进一步改善。比例尺= 3μm，插图比例尺= 1μm。
2. 门控HyD探测器用于收集大约40nm的发射带宽。所有的荧光团都用调谐到适当波长的脉冲白光激光器激发。
3. 对于共焦信道采集，AF488激发488 nm;罗丹明鬼笔环肽用561nm激发;并用647nm激发Atto 647N。所有HyD探测器门控设置为0.3-6 ns。高强度信号使得能够使用低激光功率设置，并且使用单色控制来确认不存在背景荧光。值得注意的是，用于共聚焦采集的激光功率比采用STED低3-5倍。共焦获取过程中的漂白可以忽略不计
4. 当STED激光波长和荧光团的发射光谱之间存在一些重叠时，发生光子损耗。因此，对于STED通道采集（在共焦获取之后），AF488被激发488nm，光子耗尽592nm，1.2-6nsec HyD门控;罗丹明鬼笔环素用561nm激发，耗尽660nm，1-6nsec HyD门控;并且以647nm激发Atto 647N并用6-6nsec HyD门控耗尽775nm。
5. 需要注意的是，如果荧光团能够吸收特定波长的能量（即具有包含耗尽激光器的波长的激发光谱的荧光团，592nm， 660nm或775nm）。这是因为在成像平面上的耗尽激光输出比激发源大约500-1,000倍，这将迅速导致光漂白。例如，Atto 647N将通过660nm耗尽激光进行光漂白，Alexa 594将通过592nm耗尽激光器等进行光漂白。因此，为了避免光漂白，STED通道的收集顺序至关重要，首先收集较长波长的荧光团，最后收集较短的波长。在本实验中，STED通道的收集顺序为Atto 647N，其次为罗丹明鬼笔环肽，然后为AF488。
6. 在惠更斯精华中设置了额外的去卷积参数，以解释由STED光束（STED饱和因子）抑制荧光的预期量，以及光致抗蚀剂对消耗光束（STED immunity fraction）的荧光分子的预期分数。 STED饱和因子是STED激光的绝对强度除以饱和强度。对于最大强度的STED激光，饱和因子为30，并且基于STED激光强度进行缩放。 STED免疫部分是未被STED激光耗尽的荧光团的分数。它描述为添加到纯STED PSF中的附加共聚焦PSF组分，并以最大饱和度的百分比估计。它对解卷积图像的质量影响不大，典型值约为10％。对于RSV F，STED饱和因子的值为30，STED免疫部分为14。对于F-肌动蛋白，这些值分别为27和10。对于微管蛋白，这些值分别为5和11。

笔记

为了避免在移液时干扰细胞单层，轻轻倾斜板（角度小于45°），并在分配时将移液管尖端朝向每个孔的侧壁引导。
缓慢移动以保持脆弱的细胞结构和病毒丝。
为了防止对细胞生物学的可能的干扰作用，培养A549细胞时不要包括抗生素和抗真菌剂
使用蔗糖纯化的重组RSV不用于这些研究。
在进行这些研究之前，应通过免疫斑块测定在Vero 76细胞（ATCC CRL-1587）的24孔平板上测定RSV库存的滴度。简而言之，在细胞培养基中制备感兴趣的RSV库存系列十倍稀释液。从亚汇合的Vero细胞单层的24孔板中弃去生长培养基，并将每孔100μl的连续RSV稀释液转移到24孔板的重复孔中。为了允许病毒吸附，在细胞培养箱中孵育2小时;每20分钟轻轻摇动板块，以防止单层干燥。吸附后，每孔用1ml 0.8％甲基纤维素覆盖层（使用细胞培养基制备）覆盖单层，并孵育培养物5-6天。然后通过翻转板丢弃甲基纤维素覆盖物，并用冰冷的80％甲醇固定。通过使用RSV特异性一级抗体制剂（例如市售的针对RSV的小鼠单克隆抗体）免疫染色观察RSV斑块，随后是物种特异性二抗（例如，过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG（H + L），KPL＃074-18064）和选择的检测系统（例如，CN过氧化物酶底物，KPL＃50-73-02和过氧化物酶底物溶液B，KPL＃50-65-02）。选择产生良好分离的斑块的稀释孔，每孔计数病毒斑块，并通过将平均斑块数乘以稀释因子来计算病毒库存的滴度（每毫升噬斑形成单位）。

数据分析

图像被去卷积，并使用惠更斯反卷积软件进行FWHM测量。使用PRISM软件版本7计算标准偏差。以前在（Mehedi等人，2016）中详细描述了丝状伪足驱动的RSV细胞对细胞扩散的STED显微镜观察。在这里，我们还包括一个额外的通道来显示RSV感染细胞中的微管蛋白网络。

食谱

F-12完整媒介
500 ml F-12营养组合
10％FBS
1％L-谷氨酰胺
4％PFA
30 ml 1x DPBS
10 ml 16％PFA
0.05％Triton X-100
50ml 1x DPBS
250μlTriton X-100
3％BSA
50ml 1x DPBS
1,500μlBSA（1 mg / ml）

致谢

这项研究得到了NIAID，NIH的校内研究计划的支持。所有作者都宣称不存在竞争利益。该协议是从以前发表的工作中采用的（Mehedi等人，2016）。

参考

Bachi，T.和Howe，C。（1973）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4128827”target =“_ blank” >呼吸道合胞病毒的形态发生和超微结构 12（5）：1173-1180。
Collins，PL，Hill，MG，Camargo，E.，Grosfeld，H.，Chanock，RM and Murphy，BR（1995）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“https：//www.ncbi来自克隆cDNA的感染性人呼吸道合胞病毒的生产确认了来自M2的5'近端开放阅读框的转录延伸因子的重要作用。基因表达中的mRNA，并提供疫苗开发的能力。 Proc Natl Acad Sci USA 92（25）：11563-11567。
Hell，SW and Wichmann，J。（1994）。通过受激发射来破坏衍射分辨率极限：受激发射 - 耗尽荧光显微镜。选择亮点19（11）：780-782。
Le Nouen，C.，Munir，S.，Losq，S.，Winter，CC，McCarty，T.，Stephany，DA，Holmes，KL，Bukreyev，A.，Rabin，RL，Collins，PL and Buchholz，UJ（ 2009）。单核细胞衍生的人树突状细胞的感染和成熟人类呼吸道合胞病毒，人类偏肺病毒和人类副流感病毒3型细胞。恶性病毒385（1）：169-182。
Mehedi，M.，McCarty，T.，Martin，SE，Le Nouen，C.，Buehler，E.，Chen，YC，Smelkinson，M.，Ganesan，S.，Fischer，ER，Brock，LG，Liang，B 。，Munir，S.，Collins，PL and Buchholz，UJ（2016）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27926942”目标=“_ blank”>肌动蛋白相关蛋白2（ARP2）和病毒诱导的丝状伪足促进人呼吸道合胞病毒传播。 PLoS Pathog 12（12）：e1006062。
Westphal，V.，Rizzoli，SO，Lauterbach，MA，Kamin，D.，Jahn，R。和Hell，SW（2008）。＆lt; a class =“ke-insertfile”href =“http：// science。科学 320（5873）：246- 249.