材料和试剂

注意：有关文本中缩写的全称，请参阅补充文件中的表S1

过滤嘴，0.5-10μl，超薄，表面优化（NERBE PLUS，目录号：07-613-8300）
过滤嘴，0-200μl，超薄，表面优化（NERBE PLUS，目录号：07-662-8300）
过滤嘴，0.5-10μl，超薄，表面优化（NERBE PLUS，目录号：07-695-8300）
空的和干净的果汁小瓶（NERBE PLUS，目录号：11-881-0052）
纤维素塞（NERBE PLUS，目录号：11-881-1010）
0.22μm灭菌过滤器过滤（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
1.5ml反应管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
2 ml收集管
无菌旋转拭子（Greiner Bio One International，目录号：420180）
X-tracta Tips（Biozym Scientific，目录号：615935）
氮（AIR LIQUIDE Deutschland，目录号：I4001S10R2A001）
PowerSoil DNA分离试剂盒（新品：Quiagen DNeasy PowerSoil Kit）（QIAGEN，目录号：12888）
注意：此套件的注意事项来自MOBIO，过去也称为Power Soil Kit！
从100％乙醇稀释的70％乙醇（Carl Roth，目录号：9065）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：EO0491）
Phusion ®热启动DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：F540L）
水晶琼脂糖（BIOLABPRODUCTS，目录号：16-005-805）
100bp DNA梯（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15628019）
GeneRuler 50 bp DNA梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：SM0371）
qPCR Bio SYBR-Hi-ROX（NIPPON Genetics，目录号：PB20.12-20）
脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）（Promega，目录号：U1330）
Oligo dT 7底漆（定制，Thermo Fisher Scientific订购）
用于qPCR的靶基因的寡核苷酸（定制，Thermo Fisher Scientific订购，使用[20μM]）
RT-PCR级水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：AM9935）
MinElute凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28604）
Qubit dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q32851）
Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter，目录号：A63882）
飞行介质（参见食谱）
1. 玉米粉（MühleSchlingemann，目录号：DAV-17080）
2. 啤酒酵母（Leiber，目录号：17001636）
3. 葡萄糖（Carl Roth，目录号：6780）
4. 琼脂（Carl Roth，目录号：5210）
5. 糖打糖浆（Kanne Brottrunk，目录号：2201）
6. 糖蜜（Biohof Heidelicht，目录号：013aa）
防蝇剂：
1. 尼泊金/ 4-羟基苯甲酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：H5501）
2. 丙酸（Carl Roth，目录号：6026）
10倍磷酸缓冲盐水（PBS）（参见食谱）
1. 氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：P029）
2. 氯化钾（KCl）（Carl Roth，目录号：6781）
3. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Carl Roth，目录号：P018）
4. 二水合磷酸氢二钠（Carl Roth，目录号：4984）
10倍TBE（Tris-Borat-EDTA）缓冲液（参见食谱）
1. Tris（Carl Roth，目录号：4855）
2. 硼酸（Carl Roth，目录号：6943）
3. Na 2 EDTA（Carl Roth，目录号：X986）

设备

Eppendorf Research ® plus，单通道，变量，0.1-2.5μl，深灰色（Eppendorf，目录号：3120000011）
Eppendorf Research ® plus，单通道，变量，0.5-10μl，浅灰色（Eppendorf，目录号：3120000020）
Eppendorf Research ® plus，单通道，变量，2-20μl，黄色（Eppendorf，目录号：3120000038）
Eppendorf Research ® plus，单通道，变量，100-1,000μl，蓝色（Eppendorf，目录号：3120000062）
高压灭菌器
无菌台（NuAire，型号：NU-437-400E）
麻醉手枪（吹枪）（GENESE Scientific，型号：54-104）
杜邦镊子＃5（精细科学工具，目录号：11252-20）
剪刀（Bioform，型号：B37e）
Vortexer（Scientific Industries，型号：Vortex Genie 2，目录号：SI-0256）
涡旋适配器（MO BIO，目录号：13000-V1）
Thermomixer（Eppendorf，型号：Thermomixer Comfort）
离心机（Eppendorf，型号：5424）
Qubit 3.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：Q33216）
Sensoquest labcycler（BIOLABPRODUCTS，目录号：11-011-101-096）
NanoDrop 3300荧光计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDrop TM，目录号：ND-3300）
25℃培养箱（AQUALYTIC，型号：TC 140 G，目录号：438210）
StepOne qPCR循环仪（Thermo Fisher Scientific，目录号：4376357）
Gel Doc TM XR +凝胶文献系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Molecular Imager Gel Doc TM XR +，目录号：1708195） br />
宽的Mini-Sub ® Cell GT卧式电泳系统，15 x 10厘米托盘，带PowerPac TM基本电源（Bio-Rad实验室，目录号：1640301） />
安捷伦生物分析仪（Agilent Technologies，型号：2100 Bioanalyzer，目录号：G2939BA）
水浴
1.5升烧杯

软件

MOTHUR v1.23.1
R统计软件包v.2.13.1（R_Development_Core_team，2011）

程序

中等制备
1. 通过在120℃高压灭菌20分钟来烹制所需的无菌飞行培养基（参见食谱）。
2. 将空的清洁果汁清洁干净的小瓶，并在安全柜下通过紫外线插入至少30分钟（图1A）。
3. 让介质冷却至65°C，并在无菌条件下加入防腐剂（如有必要）
4. 在无菌条件下将无菌飞行培养基倒入去污的果蝇小瓶中（图1B）。
5. 让介质在安全柜下干燥并将小瓶塞住（图1C）
6. 可以将无菌培养基在4℃下储存在无菌塑料盒中
  
  图1.无菌培养瓶的制备。：一种。将空的（标记）小瓶和新鲜的塞子放在无菌台下，并使用紫外线对其进行灭菌至少30分钟。 B.在工作台上清洗后，将小瓶中的新鲜无菌培养基滗析，让培养基干燥约45至60分钟。 C.塞上小瓶。小瓶可以在无菌盒中保存在4°C。
粪便收集
1. 使用吹枪（麻醉手枪）用氮气麻醉苍蝇。将无菌条件下将30至50只蝇的群体转移到无菌的果蝇小瓶中，并使其在25℃下排便24小时（图2A）。
2. 然后，在无菌条件下转移到新的小瓶，或丢弃它们。
  注意：图2B和2C显示了24小时后小瓶和粪便点的外观如何。
  
  图2.小瓶中的粪便。将30至50只苍蝇转移到无菌制备的小瓶中，并使苍蝇在25°C排便大约24小时，以进行标准野生型或交叉处理。 B. 24小时后，可以看到整个小瓶上有许多粪便斑点（图2C显示放大倍率，红色箭头仅标记几个点，以便更好地理解）。
3. 将无菌旋转拭子，无菌1x PBS（见食谱），无菌剪刀和含有安全柜下面的粪便的果蝇小瓶（图3A）放置。
4. 为了更好的控制，使用无菌过滤器过滤所需量的1x PBS（图3B）
5. 用无菌1x PBS浸泡无菌旋转拭子（图3C;准备步骤5-8，见视频1）。
6. 打开小瓶，并用浸泡的旋转拭子小心地收集粪便。
  注意：不要与介质接触（图3D和3E）。
  
  图3.粪便收集。：一种。所有使用的材料的紫外线灭菌，例如1x PBS缓冲液，单个棉签，无菌注射器，剪刀和反应管。 B.使用注射器过滤器再次过滤所需量的1x PBS。 C.用新鲜制备和过滤的1×PBS浸泡无菌拭子。 D.开始从小瓶收集/拭拭所有粪便点。只能从墙上忽略插头上的斑点，并注意不要用拭子（E）触摸介质。 F.在25℃下24小时后从40只蝇中收集粪便斑点。
  
  Video 1. Feces collection
7. 将旋转拭子转移到反应管中，并用无菌剪刀小心地切掉棒（图4C）
8. 关闭反应管。
9. 使用与使用的培养基相同的一天制备的空培养基小瓶，以相同的方式制备阴性对照。
10. 用无菌1x PBS浸泡无菌旋转拭子（图3C）
11. 打开小瓶，并用浸泡的旋转拭子小心地收集粪便（图4A）
12. 收集后，NTC（无模板控制）拭子不显示粪便（图4B）。
  注意：请勿与介质接触（图3D和3E）。
  
  图4.阴性对照需要在每个隔离时间点准备的阴性对照（NTC），以检查小瓶的污染并具有用于后续分析的基准。始终以负面控制开始。 A.取一个空的培养瓶（与处理小瓶相同的电量）; "收集"后的棉签C.将棉签转移到Mobio电力土壤管中
gDNA分离（制造商的数据进行了一些简单的修改）
1. 向反应管中加入60μl溶液C1（Power Soil Kit）和20μl蛋白酶K。混合反应管。
  注意：如果溶液在室温下沉淀，将其加热至60℃直至再次均匀（图5A-5C）。
2. 在温热混合器中，将样品在50℃和750rpm下孵育2小时（图5D）
3. 涡旋（涡流适配器）将样品以最高速度进行10分钟（图5E）
  
  图5.使用MOBIO Power Soil Kit进行隔离的第一步。：一种。加入60μl的C1（A，B）使用无菌过滤嘴。 C.加入20μl蛋白酶K（步骤加入制造商协议），并使样品在50℃的温度振荡器（750rpm）中孵育2小时（D，STEP ADDED TO MANUFACTURERS PROTOCOL）以诱导蛋白酶K活性。 E.将小瓶转移到MOBIO Vortex适配器中，以最高速度摇动10分钟。样品将看起来略带橙色，并且可以在磨碎的硅酸盐夹板上的小瓶中显示出一个坚实的橙色或红色粉末。这是绝对正常的。按照制造商的协议进行。
4. 将样品以10,000 x g在20°C离心30秒。
  注意：最大10,000 x g，管子可以在更高的转速下断裂！
5. 在无菌的2 ml收集管中吸取400μl上清液
6. 向上清液中加入250μl溶液C2（Power Soil），旋转5秒
7. 在4℃下孵育样品5分钟，并在20℃下以10,000×g离心60秒。
8. 在无菌的2 ml收集管中吸取高达550μl的上清液
9. 向上清液中加入200μl溶液C3（Power Soil），并迅速旋转
10. 在4℃下孵育样品5分钟，并在20℃下以10,000×g离心60秒。
11. 在无菌的2ml收集管中吸取不超过600μl的上清液，加入1,200μl的C4（摇匀溶液4次，然后使用！）并旋转5秒。
12. 因为最大旋转柱容量为675μl，所以只将600μl步骤C11的混合物移液到柱上，在20℃下以10,000xg离心60秒。放弃流程并重复此步骤两次。
13. 然后，通过将500μl的C5吸移到柱上来洗涤柱。
14. 以10,000 x g离心30秒。
15. 通过在20℃离心10分钟60分钟，在20℃下离心流经并干燥柱子。
16. 将自动过滤器（色谱柱）放入新的无菌收集管中
17. 将30μlTE移至色谱柱的中间并孵育1分钟
18. 在20℃下以10,000×g离心柱30秒。
19. 处理自动过滤器。
20. gDNA可以保存在-20°C。
注意：保持每个隔离运行的负控制！
进一步实验
gDNA提取后，使用Qubit 3.0荧光计测定gDNA浓度。该gDNA可用于通过qPCR或MiSeq进行进一步分析（Fink等人，2013年描述的454次测序）。
注意：＆NBSP;
1. 您需要至少5 ng /μl的元素
2. 在进行实验之前，请检查所有感染Wolbachia感染的菌株。在某些情况下，Wolbachia OTUs（操作分类单位）将在您的454个全套样品或肠样品数据集中占主导地位。如果将粪便样本与全组织样本进行比较，这一点很重要。
1. PCR扩增
  对于PCR扩增，我们在25μl反应体积中使用2.5μl的gDNA作为模板。使用0.25μlPhusion 热启动DNA聚合酶，0.5μl有义和反义引物（各10mmol）;对于PCR扩增，使用Sensoquest labcycler。使用一般的Wsp （Wolbachia 特异性）引物81F（5'-TGGTCCAATAAGTGAAGAAAC-3'）和691R（5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'）[10mM]扩增Wolbachia 16S RNA基因（Braig et al。，1994）。为了检查分离的DNA昆虫特异性线粒体的质量，使用12S核糖体DNA引物，12SAI（5'-AAACTAGGATTAGATACCCTATTAT-3'）和SBI（5'-AAGAGCGACGGGCGATGTGT-3'）（Simon等人， >，1994）。 PCR条件为：98℃初始变性30秒; 98℃9秒，55℃30秒，72℃30秒35个循环。结果用图6中的凝胶电泳表示，使用1x TBE中的1.5％晶体琼脂糖（参见食谱）。
  
  图6. Wolbachia污染物的PCR分析。：一种。在泳道1,3和5中使用Wolbachia特异性寡核苷酸（Wsp 81F，Wsp 691R）的PCR结果。显示粪便样品是免费的的Wolbachia 污染。批准DNA分离的成功gDNA特异性12S引物用于第2,4和6号（12SAI和12SBI）（Fink等人，未发表的数据）。
2. qPCR扩增
  使用5μlqPCR Bio SYBR-Hi-ROX，在10μl总反应体积为10μl的10μl反应中进行PCR，所述反应含有2μl的gDNA模板。当与其他物种特异性扩增相比时，将一般V2引物用作一般检测引物或对照引物[8pmol]。使用StepOne Cycler的PCR条件为：在95℃下保持10分钟;在95℃下循环40个循环，10秒，60℃退火30秒，作为数据收集的时间点。熔融曲线阶段：在95℃下10秒，60℃下5秒，每0.3℃开始收集数据，直到95℃的温度达到10秒。
3. 454程序
  1. 对于16sRNA基因的PCR扩增，使用侧翼于高变体V1和V2区域的311个核苷酸序列。对于每个样品，使用复合转发扩增16S rRNA基因：
    （5'-CTATGCGCCTTGCCAGCCCGC TCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向（5'-CGTATCGCCTCCCTCGCGCCA TCAGXXXXXXXXXXCA TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 '）引物。这些引物包括454生命科学适配器A（用于反向引物）和B（用于正向引物） - （用斜体标记）。此外，向反向引物加入10bp条形码（称为XXXXXXXXXX）。带下划线的序列代表广泛保守的细菌引物27F和338R。添加了两碱基连接序列（TC / CA）和四碱基键（TCAG）（参见补充文件）。扩增混合物含有按照标准方案使用的Phusion 热启动DNA聚合酶（98℃初始变性30秒; 98℃9秒，55℃30秒） ℃，72℃30秒; 72℃最终延伸10分钟）。参见图7中放大后的结果。
  2. 所有样品都重复完成。 PCR后结合重复。使用QIAGEN MinElute凝胶提取试剂盒提取PCR产物，并在NanoDrop 3300荧光计上用Quant-iT dsDNA BR测定试剂盒定量。合并等摩尔量的纯化的PCR产物，并使用Ampure Beads（Agencourt）进一步纯化。在乳液PCR（Rausch等人，2011; SI）和制造商推荐的测序之前，在Agilent Bioanalyzer上运行每个文库的样品。随后使用Titanium测序化学（Fink等人，2013）在454 GS-FLX上对Amplicon文库进行测序。
    
    图7.用于PCR质量检查和凝胶提取的凝胶电泳。样品显示约400bp的扩增子大小。每个扩增包括阴性对照（负Ktr。）。通过使用Gel Doc TM XR + X-tracta Tips来切断样品。所有代表的阴性对照在这里都没有污染。如果阴性对照（NTC）显示任何污染，请在PCR中重新运行样品。

数据分析

注意：对于统计分析，您应该为每个治疗提供至少三个独立的生物重复，建议最好准备五个。

qPCR数据分析
我们将PCR反应的循环阈值（Ct）与来自与跨越高变区V1和V2（上述V2）的通用细菌引物的反应相比，将来自不同细菌种类的引物使用的引物与Ct进行比较。通过相对比较，我们试图控制样品中存在的细菌总量。我们在技术重复之间平均了Cts，其导致使用以下等式生成单个Ct值：子>。然后使用三个生物重复的中值ΔCt将细菌丰度的相对对数测量值转换为线性标度。在PCR反应的对数期间，我们假设每个循环的PCR产物的量加倍：x-fold =2ΔCt（Fink等人，2013年）
454数据分析

根据使用MOTHUR v1.23.1（Schloss，2009）的多路复用标识符（MID）标签将454个读取分组成组。在该过程中，去除了标签和引物序列。只保留了完全匹配MID和细菌引物的序列。所得序列根据以下条件进行质量过滤：每个50个碱基对窗口中的最小平均质量为35，最小长度为260bp，均聚物不超过8bp。使用标准设置的MOTHUR实现的kmer（包含在字符串中的长度为k的所有可能的子串）算法将筛选的序列与SILVA参考数据库（Pruesse等人，2007）进行比对。删除在预期区域不对齐的序列。
使用MOTHUR pre.cluster命令对传送序列进行过滤以进行测序。然后使用Uchime（Edgar等人，2011）在MOTHUR中使用标准设置来搜索序列。确定为嵌合体的序列被丢弃。使用SILVA参考数据库和分类法将序列分类为MOTHUR中的classify.seqs命令的细菌分类单元。使用R统计软件包v.2.13.1（R_Development_Core_team，2011）绘制结果。使用具有平均邻域算法的MOTHUR进行到OTU的聚类序列。（Fink等人，2013）。示例堆叠图在图8中表示。

图8. 454序列后检测到的OTU的相对丰度的堆积图。在野生型实验室菌株中，Wolbachia 感染/污染也可以在测序后的454个数据集中检测（B ，全飞，肠样品）。如果存在Wolbachia 感染，则相对丰度（Y轴）所反映的大部分读数是Wolbachia 规范中的读数。这导致在这些样品中不可能发现任何其他细菌丰度的效果。这不会影响粪便样品（Fink等人，未发表的数据）。

笔记

隔离总是可重复的。从进一步的分析可以看出，一个治疗组的样本之间没有高的变异性。见图8，粪便样本：您几乎拥有所有现有细菌的丰富度。有时，尽管在相同的运行中提取样品，但可能会发生随机抽样缺失。因此，我们建议每个治疗组总共准备五个样品。
始终关心无菌环境，工作空间和工具。在进一步的实验中可以直接看到任何污染物。
小心收集时不要用拭子触摸介质（见图3E）。

食谱

飞行介质（1.5L烧杯）
62.5克玉米粉
62.5克啤酒酵母
10g琼脂 -
20 g葡萄糖 30克糖蜜
20克糖糖浆
在1 L ddH 2 O
中添加在100°C水浴中烹调培养基10-15分钟在120°C高压灭菌15-20分钟
在加入防腐剂之前将介质冷却至60°C 30毫升尼泊金（10％）
10ml丙酸（10％在EtOH中）
准备小瓶在清洁工作台下。每瓶加入大约10毫升
10倍磷酸缓冲盐水（PBS）
80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4•2H 2 O
2.4g KH PO 4
1 L ddH 2 O
在120°C高压灭菌15-20分钟
将pH调节至7.4
注意：在使用之前，将10x储存缓冲液稀释1至10，ddH2O新鲜使用。
10倍TBE（Tris-Borat-EDTA）缓冲液
108克Tris
55克氧化硼
40ml的0.5M Na 2 EDTA 1 L ddH 2 O
在120°C高压灭菌15-20分钟
将pH调节至8.0
注意：使用前，将10x储存缓冲液稀释1至10，ddH 2 O。

致谢

我们感谢Britta Laubenstein，Christiane Sandberg和Katja Cloppenborg-Schmidt的出色技术支持。作为CRC 1182（项目C2）和卓越炎症接口丛集的一部分，这项工作得到了德意志福神学院的支持。

参考

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