材料和试剂

剃刀刀片
1.57mm OD聚乙烯管（例如，粘土亚当斯公司，Intramedic ，BD，目录号：427431）
Sephadex微量离心柱（Illustra Microspin G-25）（GE Healthcare，目录号：27-5325-01）
塑料包装（例如，，Fisherbrand Clear Plastic Wrap，Fisher Scientific，目录号：22-305654）
C折纸巾（例如，Scott纸巾，KCWW，Kimberly-Clark，目录号：01510）
带正电荷的尼龙DNA印迹膜（Hybond-N +，30.0×50.0cm）（GE Healthcare，目录号：RPN3050B）
色谱转印纸（Whatman 3MM，46.0 x 57.0 cm）（GE Healthcare，目录号：3030-917）
注射针头（例如，，B-D 18 G 1 1/2精准度针/针）（BD，目录号：305196）
phiX174病毒粒子DNA，1mg / ml（New England Biolabs，目录号：N3023L）
Phi29 DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0269S）
100mM dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）组（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0181）
1μMCMG（Cdc45 Mcm2-7纯金）解旋酶（见Georgescu等人。[2014]）以获得细节）
pUC19,1mg / ml（New England Biolabs，目录号：N3041L）
Bsa 使用CutSmart缓冲液的I-HF（New England Biolabs，目录号：R3535L）
'blockLd'oligo *
'blockLg'oligo *
'Pr1B'oligo *
'160Ld'oligo *
'91Lg'oligo *
'Fork primer'oligo *
核苷酸偏置模板（由Biomatik，Wilmington DE合成）*

*注意：请参阅补充文件1 。

T4连接酶，包括10x连接酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0202M）
100mM ATP（GE Healthcare，目录号：27-2056-01）
0.5M EDTA，二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
5M NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
Sepharose 4B尺寸排阻色谱树脂（GE Healthcare，目录号：17012001）
1 kb MW标记（New England Biolabs，目录号：N3232L）
溴化乙锭（EthBr，10mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15585011）
T4激酶和10x T4激酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0201L）
P-γ-ATP，3,000Ci / mmol，3.3μM（PerkinElmer，目录号：BLU002A）
XI型低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3038）
注意：本产品已停产。
CI（新英格兰Biolabs，目录号：R0647L）
β-琼脂糖酶I（New England Biolabs，目录号：M0392L）
3 M乙酸钠（CH 3 COONa），pH 5.2（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：190764）
糖原，分子生物学级（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0561）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
1μMRFC（复制因子C;参见Georgescu等人。 [2014]，用于净化细节）
5μMPCNA（增殖细胞核抗原;见Georgescu等人。[2014]），用于纯化细节）
2μMPolε（参见Georgescu等人。[2014]，用于纯化细节）
2μMPolδ（参见Georgescu et al。[2014]，用于纯化细节）
2μMPolα（参见Georgescu et al。[2014]），用于纯化细节）
20μMRPA（复制蛋白A;见Georgescu等人）[2014]，用于纯化细节）
P-α-dCTP，3,000Ci / mmol，3.3μM（PerkinElmer，目录号：BLU013H）
P-α-dGTP，3,000Ci / mmol，3.3μM（PerkinElmer，目录号：BLU514H）
LE琼脂糖（BioExpress，GeneMate，目录号：E-3120-500）
10N氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：SS255）
甘油
二甲苯甲醇
Tris-HCl，pH 8.0
Tris碱（RPI，目录号：T60040-500.0）
硼酸（RPI，目录号：B32050-5000.0）
柠檬酸钠
1丁醇
Tris-醋酸盐，pH7.5
牛血清白蛋白（BSA）（New England Biolabs，目录号：B9000S）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）pH7.5
100mM二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：R0861）
谷氨酸钾
醋酸镁
1％SDS
6x凝胶加载染料（见配方）
TE缓冲液，pH 8.0（参见食谱）
10x TBE（Tris /硼酸盐/ EDTA;参见食谱）
DNA洗脱缓冲液（参见食谱）
20x SSC（见配方）
1-丁醇饱和水（见食谱）
5x TDBG（见配方）
10x MK（见配方）
dA / dC混合（见配方）
dT / dG混合（见配方）
T / G / C混合（见配方）
停止解决方案（请参阅食谱）
碱性运行缓冲液（见配方）

设备

加热块（例如，，VWR，目录号：12621-084）
馏分收集器（例如，，Gilson，型号：F203B）
可变模式凝胶成像仪（例如，，GE台风）
UV-vis分光光度计（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：NanoDropTM 2000）
真空干燥器（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，Sup。TM，目录号：5309-0250）
紫外灯箱
UV阻挡面罩（例如，Sigma-Aldrich，目录号：F8142）
注意：本产品已停产。
微量离心机
电导率计（例如，，辐射计医疗，型号：CDM 80）
带微量离心机托盘的温度控制水浴（例如，LabX型号：Lauda E100和Brinkman 30x x 1.5ml）
制造商：LAUDA-Brinkmann，型号：E100。
磷光成像屏幕（GE Healthcare）
荧光成像仪（例如，，GE台风）
重的重量
注意：我们使用我们发现的巨型铅块;一个〜50磅的哑铃会奏效。
使用ImageJ和电子表格软件（例如，，Apache Open Office）的计算机安装了
1×30cm玻璃柱（例如，玻璃Econo-Columns）（Bio-Rad Laboratories，目录号：7371032）
100 ml琼脂糖凝胶电泳仪
泡沫塑料盒足够大，适合100 ml琼脂糖凝胶电泳仪
电泳电源（例如，，Pharmacia Biotech，目录号：EPS 3500 XL）
分析结果
保护性有机玻璃样品屏蔽
20×14cm水平琼脂糖凝胶电泳装置（C.B.Science，目录号：SGU-014T-02）

软件

ImageJ（ https：//imagej.nih。 GOV / IJ /文档/菜单/ analyze.html＃凝胶）

程序

线性分叉DNA模板构建
我们主要使用两种类型的线性叉状DNA底物来测定引导/滞后链复制：基于线性pUC的天然序列底物（以下称为3kbf，用于3kb叉）和3.2kb核苷酸偏向的前导/滞后链底物，其合成生成，使得一条链不具有dC，另一条链不具有dG（称为3nbf，对于3kb核苷酸偏置的叉）。 3nbf底物可用于领先和滞后的链测定，以独立于另一条来监测每条链（参见图1）。我们有时候更喜欢使用5' - sup 32标记的引物来定量引导链复制，因为它是使用引物延伸的直接报告基因，与使用 32 P-dNTPs因为它缺乏潜在的终端标签工件。尽管两种底物都可以适应引物，但我们通常只使用3kbf底物用于此目的，因为制备起来要简单得多（例如，不需要从低浓度纯化3kb合成核苷酸偏向部分熔融凝胶）。尽管这些底物之间的模板长度和组成不同，但是我们使用与这些底物连接的相同的小型合成叉结构。
叉子由一个160杆的前导链组成，一个91杆的后备链。前导链含有用于CMG负载的3'（dT）亚基末端，37个核苷酸引物退火位点，其后是缺少dC和dA残基的4个核苷酸区域以及缺少dC和dT残基的10个核苷酸区域（参见寡核苷酸组合物的配方）。引物上游的4个核苷酸区域允许通过仅包括dATP和dCTP（即，以防止Polε的3'-5'核酸外切酶活性降解）来引导链上的Polε"空转"引物）。 10个核苷酸区域阻止潜在的错配（即，即使是dTTP被扣留）之后的"失控"Polε。按照这些顺序，我们在设计成适应CMG（〜10nm）的覆盖区的叉结上包括（dT）<40>间隔物。滞后链含有（dT）60'末端和与前导链的5'末端互补的35bp。前导链叉模板寡核苷酸通常含有四个3'硫代磷酸酯键，以通过用硫原子替代寡核苷酸主链中的非桥连磷酸酯氧原子来保护DNA聚合酶中固有的外切核酸酶活性（可作为DNA合成公司的修饰）作为IDT）。核苷酸偏置底物的示意图见图1

图1.核苷酸偏置底物的示意图。显示"3nbf"底物，包括文中描述的寡核苷酸，其相关特征突出显示。偏置被设计为使得在前导链合成期间将仅引入 32 P-α-dCTP，而在滞后链合成期间仅包含P-α-dGTP 。虚线表示文中讨论的限制酶切位点。注意，使用相同合成叉构建但使用具有天然（无偏）序列的2,686bp模板的"3kbf"底物未显示。

3kbf底物构建（通常用于使用 32引物的引物链反应）
1. 在TE缓冲区中重新悬浮"160Ld"至20μM（请参阅食谱）
2. 在TE缓冲区中将"91Lg"重悬浮至500μM
3. 在1x CutSmart缓冲液中，将37 pmol pUC19与4μlBsa I-HF（20U /μl）一起消化，共37℃，4小时。
4. 在75°C下热灭活I-HF 30秒。
5. 在TE中加入17.5μl（350pmol）160Ld和4.2μl（2100pmol）91Lg，并加入238.3μlTE至400μl。
  注意：为了防止线性化pUC19的串联化，需要10：1过量的叉模板，并且将6L超过91Lg至160Ld，以确保所有连接的160Ld退火到91Lg。
6. 退火通过加热至95°C 5秒钟，使热板在台面上冷却至RT模板
7. 通过加入15μlT4连接酶，36μl10x CutSmart缓冲液，4μl100 mM ATP（最终为1 mM）将引导叉引导到线性pUC19上，加入TE至400μl体积。在16℃下孵育≥16小时。
8. 加入10μl0.5 M EDTA，螯合Mg 2 +
9. 加热使T4连接酶在65°C下灭活20秒
10. 加入10μl5M NaCl，使[NaCl]至> 100 mM（必需防止非特异性结合Sepharose 4B色谱柱）
11. 倒入〜20ml Sepharose 4B柱，并平衡>冷的DNA洗脱缓冲液的2个柱体积（CV）（参见食谱）。
12. 将注射器针头调整到柱的末端。将聚乙烯管道连接到注射器末端，并将其连接到馏分收集器，使装置达到所有管道所需的最小长度。
13. 向20ml Sepharose 4B柱中加入420μl反应液，确保在加载反应体积之前，缓冲液已完全渗入柱床。
14. 样品完全穿透柱床后，用冷DNA洗脱缓冲液加入并洗脱
15. 收集〜227μl的分数（10滴/ fxn为我们使用的油管）。在这些条件下，模板应该在馏分20上洗脱。
16. 在1％TBE琼脂糖凝胶上运行7μl每个级分，同时在100 V下加入1 kb MW标记（带有凝胶加载缓冲液），直至溴酚蓝标记达到2/3。
17. 用1×TBE中的2-5μlEthBr染色并在凝胶成像仪上观察。
  注意：
  1. 线性化质粒从结扎叉DNA的凝胶转移非常小，所以不要期待看到差异。然而，连接的叉DNA将比过量的游离合成分叉DNA更早地洗脱，其可以在适当染色/脱色的凝胶上显现。
  2. 我们用放射性标记的叉进行量化叉结，高效（> 95％）高效，因此3kb模板在上述条件下连接到DNA叉。
  3. 尽管如此，我们鼓励用户使用32P标记的叉DNA实际监测其连接效率，以确保连接，并使用phi29 DNA聚合酶延伸32P标记的引物（即参见下文）以进一步确保结扎效率。
18. 保存含有〜2.7 kb谱带的级分（这将是所有级分中唯一可见的谱带），并使用UV / Vis分光光度计通过A 260测量DNA浓度。
19. 按照制造商的方案，用T4激酶和 32 P-γ-ATP对引物进行5'-末端标记。我们通常使用25μl反应，终浓度为400 nM。使用已经用TE平衡的G-25柱，根据制造商的方案，将游离的 32 P-γ-ATP净化。
20. 为了用 32 P引物引入3kbf底物，加入所需量的3kbf底物与等摩尔量的 P引物。最小化总体积，加入20x SSC（见配方）至最终1x浓度，加热至95°C，并在台式机上冷却至RT。
3nbf基板构造
1. 在TE缓冲区中将"160Ld"重新悬浮至20μM。
2. 在TE缓冲区中将"91Lg"重悬浮至500μM
3. 含有3.2 kb核苷酸偏置模板的Digest〜400μg质粒（请参阅补充文件1 ） 7 h。
4. 在上一步骤完成之前，在0.8％TBE琼脂糖凝胶上以100V运行0.5μl，直到溴酚蓝达到2/3，以确保完全切割。如果切割不完整，请添加更多的Bsa I-HF并消化更多;重复直到切割完成。
5. 加入12μlBts CI（20 U /μl）加上足够的10x CutSmart缓冲液，并补充添加的体积。在50°C孵育6 h。
6. 在消化完成之前，如步骤4（程序A，3nbf底物构建）在凝胶上运行0.5μl，以确保完整的消化。
7. 加入21.5μl0.5 M EDTA
8. 将样品置于真空干燥器中6-8小时，减少体积约1/3
9. 在1.2％TBE低熔点琼脂糖凝胶上运行整个样品（共15个梳齿牙齿中的8个）。加入2μl10 mg / ml EthBr至100ml凝胶。预冷TBE，每100 ml运行缓冲液中加入2μl10 mg / ml EthBr。运行在40-50 V，仪器坐在装有冰水的聚苯乙烯泡沫塑料箱（冷室不足），直到溴酚蓝达到凝胶的三分之一。穿上紫外线防护面罩，在UV灯箱上显现，并用剃须刀切出最大的（3,260bp）带。称量凝胶切片进行下一步骤。
10. 在65°C的熔体凝胶切片。
11. 称量熔融切片，加入1/9 V Tris-HCl，pH 6.8和1/224 V 0.5 M EDTA，粗糙度近似为凝胶密度为1 g / ml。
12. 冷却至42°C。
13. 每克凝胶加入〜5μlβ-琼脂糖酶I。在42℃孵育5-7小时。
14. 重复步骤13（程序A，3nbf底物构造）。
15. 异丙醇沉淀DNA片段加入体积为3M的乙酸钠（pH5.2）的1/10，然后加入等体积的异丙醇。在-20°C孵育1小时。在微量离心机中以≥15,000x g旋转30分钟。
  注意：如果太多的琼脂没有被足够小的低聚糖消化，你会看到很多白色沉淀。您将需要完成沉淀，重新悬浮在水溶液中，并返回到步骤13（程序A，3nbf底物结构），以进行进一步的β-琼脂糖酶I消化。
16. 弃去上清并在TE pH 8.0中重悬沉淀。
17. 通过用等体积的1-丁醇饱和水提取除去EthBr（参见食谱）。轻轻涡旋混合。以1,500 x g旋转，节省底部解决方案。继续提取，直到没有可见的粉红色。提取3次以上。
18. 乙醇沉淀物
  加入1μl糖原（20mg / ml），1/10体积的3M磷酸钠pH 5.2，然后加入等体积的冷乙醇。在-20°C孵育1小时。旋转微量离心机≥15,000x g 30分钟。
19. 将DNA重悬于150μlTE pH 8.0
20. 在0.8％TBE琼脂糖凝胶上运行2μl，4μl和8μl1:10和1:100稀释液以估计浓度。
21. 使用35 pmol的这种材料用于后续步骤。
22. 在TE中加入350 pmol 160Ld和2100pmol 91Lg，并加入TE至300μl。
  注意：需要10：1过量的叉到模板以防止串联，并且6：1超过91Lg到160Ld是确保所有连接的160Ld退火到91Lg。
23. 退火通过加热至95°C 5秒钟，使热板在台面上冷却至RT模板
24. 通过加入15μlT4连接酶，36μl10x CutSmart缓冲液，4μl100 mM ATP（最终为1 mM）将引导叉引导到线性pUC19上，加入TE至400μl体积。在16°C孵育至少16小时。
25. 加入10μl0.5 M EDTA，螯合Mg 2 +
26. 加热使T4连接酶在65°C下灭活20秒
27. 加入10μl5M NaCl以使[NaCl]至> 100mM（为防止非特异性结合Sepharose 4B柱所必需）。
28. 将注射器针头调整到柱的末端。将聚乙烯管道连接到注射器末端，并将其连接到馏分收集器，使装置达到所有管道所需的最小长度。
29. 倒入〜20ml Sepharose 4B柱，并平衡>冷的DNA洗脱缓冲液的2个柱体积（CV）
30. 向20ml Sepharose 4B色谱柱中加入420μl反应液，确保缓冲液在添加前已完全渗入柱床。
31. 样品完全渗透入柱床后，用冷DNA洗脱缓冲液洗脱
32. 收集〜227μl分数（10滴/分）
33. 在1％TBE琼脂糖凝胶上运行7μl每个级分，并加入1 kb MW标记（含凝胶加载缓冲液），直至溴酚蓝标记达到约2/3。
34. 在1×TBE中用2-5μl溴化乙锭染色，并在凝胶成像仪上显色。
  注意：线性化质粒从叉子束缚的凝胶移动非常小，所以不要指望看到差异。这个凝胶上的自由叉也很难看出。我们用放射性标记的叉子量化了叉结，并且极其（> 95％）的效率，因此模板应该有叉连接。
35. 保存含有〜3.2 kb谱带（这应该是唯一可见光谱带）的分数，并通过分光光度计上的A2 260测量浓度。
36. 用阻断寡核苷酸钝化分叉模板的非叉末端。在TE pH 8.0中将"blockLd"和"blockLg"重新悬浮至10μM。以2：1寡核苷酸：模板摩尔比添加每个寡核苷酸。加热至85°C 5秒钟，冷却至台式温度。
  注意：此步骤是为了防止在 32 P-α-dNTP并入期间BtsCI切割位点的最终标记（即，Pol可以使用未连接的5'突出端作为模板），然而，可以更实际地订购在该区域由钝切位点去除的核苷酸偏向序列。 />
37. 通过加入10μlT4连接酶来阻断寡核苷酸。加入1/10体积的10x T4连接酶缓冲液并用1mM ATP补充。在16°C孵育至少16小时。
38. 加热使T4连接酶在65℃灭活20秒。
启动phiX174（模型滞后链）构造
除了CMG导向的前导/滞后链合成之外，我们还发现使用引发剂的RPA涂覆的环状5.4kb ssDNA（phiX174病毒体环状ssDNA）作为模型滞后链，以便分离潜在的滞后链活性没有完整的复制上下文。
1. 在TE pH 8.0中将Pr1B重悬至5μM（参见食谱）
2. 向10 pmol phiX174 DNA（1.2：1引物：模板摩尔过量）中加入12 pmol Pr1B。加入缓冲液TE pH 8.0至57μl，加入3μl20x SSC。加热至95°C 5秒，冷却至台式温度。
复制分析
我们假设读者已经净化了重组真核生物复制品所需的全部蛋白质，包括最小的CMG解旋酶Polsε，δ和α，RFC，PCNA和RPA。其他辅助蛋白如Mcm10和Mrc1-Tof1-Csm3复合物将刺激复制，但不是活性的绝对要求。这些蛋白质的纯化和储存条件超出了本协议的范围，可以根据具体实验要求而变化，然而，蛋白质的全部纯化细节在（Georgescu et al。，2014和2015）中有描述）和（Langston等人，，2014）。记录所有蛋白质库存的浓度和盐浓度。将所需级分分成小（〜10-25μl）等分试样，在液氮中闪蒸冷冻，并储存在-80℃。
我们更喜欢使用25μl作为标准实验体积，以最大限度地减少蛋白质消耗，同时保持工作量的可控性。低至15μl或高达40μl的体积也可以正常工作。对于这里列出的协议，我们经常分为三个阶段：1）基质上的反应物加载。 2）聚合酶钳位载体，即聚合酶，RFC夹紧载体，PCNA钳位和2或3个dNTP，其允许聚合酶在模板上"空转"（核苷酸掺入和校对的重复循环）以防止引物降解，以及3）通过添加4个dNTP的全部补体来启动复制。
如果需要，可以组合前两个阶段，但是理想地，在孵育5-10分钟或更长时间期间，CMG负载到叉状DNA（或在滞后链模型的情况下的RPA涂层ssDNA）。
另一方面，第二阶段含有外切核酸酶专业聚合酶，其将降解底物和/或其引物，因此至少需要两种dNTP和与这些酶的适度孵育时间。
第三阶段通过添加所有剩余的dNTP启动正在进行的复制，而在叉分析的情况下，也是RPA。在本文给出的实施例中，制备第一底物负载相并根据需要分成管，随后加入第二酶相，并且随着反应定时器开始，添加第三起始阶段。这种分期方法有助于最小化从小量移液中产生的错误，然后将混合相分解成相对较大的体积。
由于相对于最终体积添加酶，因此也可以促进低体积的使用，使得可以以相对高的浓度进行对DNA的负载。由于每个相在混合前分别制备，因此在加入蛋白质之前，为了防止沉淀，在各相中独立地加入盐和缓冲剂（，即，TDBG，MK和任何其它所需的盐）是重要的，聚集，等等。根据蛋白质行为/溶解度要求，可能会直接将蛋白直接加入到低离子强度中。
假设在蛋白质滴定过程中实验组之间的蛋白质浓度有差异（例如，），重要的是通过向具有较低蛋白质浓度的复制的管中加入适量的盐来校正进入的盐反应对盐条件敏感。因此，必须确保盐已正确平衡。
1. 盐校准
  制作实验和/或蛋白质储存中使用的每种类型的盐的电导率对盐浓度的标准曲线，并进行正确的实验。
2. 引导和/或滞后链复制;例如3点时间段领先/滞后（3nbf）实验。
  注意：除了在3nbf实验中添加放射性核苷酸之外，以下协议对于3kbf（分叉线性模板）是相同的，如前所述。在每个阶段和时间点停止管已准备好之前，不要启动复制。
3. 使用引发的ssDNA底物的滞后链复制模型
  这是与上述类似的方案，不包括CMG，底物是引发的ssDNA圆，通常是噬菌体phiX174或M13（或M13衍生物）。因此，不需要退绕（即，即，CMG在主链上，而不是滞后链）。钳夹，钳装载体和DNA聚合酶均通过用单链结合蛋白预包被ssDNA来刺激，允许用RPA预先涂覆底物，否则可防止CMG加载。选择引物使得dC和dT的运行恰好在模板的下游，使得dATP和dGTP是用于聚合酶空转的所包含的核苷酸。
  1. 底物加载（见表2A）。
    
    表2A。滞后链模型的底物加载阶段
    
    用600nM RPA（阶段1;每个11μl）负载0.5-2.0nM滞后链模型底物（phiX174：Pr1B）。
    例如：按照以下顺序，添加16.7μlddH O，6.6μl5x TDBG（1x Final），3.3μl10x MK最终），0.75μlphiX174：Pr1b（最终1.5nM），1.5μl3mM dATP（最终60μM），1.5μl3mM dGTP（最终60μM），0.4μl100mM ATP（最终0.5mM）和2.3μl 20μMRPA（终浓度为600nM），终体积为3×11μl=33μl。在水浴中在30℃下孵育10分钟。
  2. 酶装载（见表2B）
    表2B。滞后链模式的酶装载阶段
    
    加载RFC / PCNA /α/δ。
    例如：按照以下顺序，添加23.3μlddH 2，O，7.0μl5x TDBG（1x Final），3.5μl10x MK最终），0.6μl1μMRFC（最终5nM），0.6μl5μMPCNA（终浓度25nM），0.6μl2μMPolα（10nM终）和0.6μl2μMPolδ（10nM终），用于最终体积为5×7μl反应=35μl。向每个反应管中加入21μl（3×7μl），用移液管尖端充分混合。在30℃孵育1分钟。
  3. 复制启动（见表2C）
    表2C。滞后链模型的复制开始阶段
    
    通过添加在预孵育期间被保留的核苷酸来启动复制。
    示例：按照以下顺序添加10.5μlddH 2 O，4.2μl5x TDBG（1x final），2.1μl10x MK最终），0.5μl3mM dCTP（最终20μM），1.5μl3mM dTTP（最终60μM），1.5μlT / C / G混合物（200μM终浓度），2μlT / G / C混合物μM最终）。尖峰与0.75μl P-α-dCTP（10μCi/反应）。设置一个计时器3分钟。加入21μl起始混合物;启动定时器，同时用移液器彻底混合。在1分钟，2分钟和3分钟内清除20微升的反应物，并快速转移到预先装入10μl终止液的三个试管中。
4. 复制产品可视化
  对于3nbf实验，前导链产品应类似于Georgescu等人的图1b（2015）;即，其长度随着时间的推移而增加到全长（3.2kb）〜10分钟以下的产品。使用末端标记的引物来监测3kbf底物上的引物延伸，结果应该类似于Schauer等人（2017）的图3b中的引物延伸;即，，长度随着时间的推移而增加（2.8 kb）的产品。替代指导的滞后链复制应该类似于Schauer等人（2017）图6中的那些。即，约200bp的产品。对于所有CMG导向实验，实验中的CMG或ATP的减法是良好的阴性对照，不应产生延长的产物。使用滞后链模型底物，实验应与Schauer等人的图1b类似。（2017）; ，在3分钟内稳健的全长（5.4kb）产品。
  1. 准备梯子
    按照制造商的方案，用T4激酶和 32 P-γ-ATP对1kb DNA梯度进行5'末端标记。通常，我们用50μl总共5μlT4 PNK和4μl P-γ-ATP标记20μl梯子。使用已经用TE平衡的G-25柱，根据制造商的方案，将游离的 32 P-γ-ATP净化。
  2. 准备碱性琼脂糖凝胶
    将2.6或1.6g LE琼脂糖加入200ml蒸馏的H 2 O（3nbf / 3kbf底物为1.3％，滞后链模型底物为0.8％）。微波直到沸腾冷却至至少60℃，加入0.5ml 0.5M EDTA和0.6ml 10N NaOH，然后倒入凝胶。在约2小时内冷却至室温（RT）。在水平凝胶盒中浸入碱性运行缓冲液（参见食谱）。
  3. 在凝胶中加载样品和DNA标准品。在35V下运行16小时
  4. 去除免费的放射性核素
    从凝胶盒中取出凝胶，暴露于荧光成像屏幕15分钟。在磷光体上扫描并以全尺寸打印凝胶。将打印输出部分的饱和部分切掉，将其覆盖在凝胶上，并将包含游离核素（通常为底部第三或第四）的凝胶底部切掉，以减少自身和实验室设备的暴露。当监测滞后链合成时，该区域的鉴定特别重要，因为游离放射性核苷酸不超过冈崎片段运行得太远。自由放射性核素也可以从凝胶中流出，但会污染设备，产生进一步的放射性废物，并且它们倾向于在缓冲液中扩散，并可以回到整个凝胶中并有助于背景信号。
  5. 压缩凝胶
    将塑料包裹在一个平坦的表面上，如有机玻璃辐射屏蔽的底部。将凝胶板放在纱布上。将C折纸巾平放;一个与每个凝胶边缘相邻。将一张DEAE纤维素纸放在凝胶上。在这上面放置一张或两张Whatman 3MM色谱转印纸。堆叠2个水平行〜25 C折纸巾。盖上平坦而刚性的纸巾（例如平面有机玻璃罩），以分配重量。在该组件的中心轻轻地放置重物（例如，，铅砖），并将薄（几毫米厚）压榨6-12小时。我们发现这个方法优于使用凝胶干燥器，它可以作为使DNA转移和固定在DEAE-纤维素纸上的一个步骤。
  6. 除去除DEAE纤维素外的所有纸张，包裹在塑料包装中，并根据同位素强度将凝胶面暴露于磷化筛网2-36小时。
  7. 在磷光显像仪上扫描荧光成像屏幕。

数据分析

引物扩展实验的分析在其他地方是简单直观的，大多数操作可以通过ImageJ中的Gels包处理（参见 https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#gels ）。感兴趣的参数可以是速度，引物摄取，产品长度，等等，并且将取决于实验。除了阅读Gels软件包的文档外，我们强烈建议读者阅读ImageJ用户指南（ https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ），以便在分析凝胶数据之前进行图像分析的一般帮助。
当使用放射性核苷酸掺入时，使用DNA梯度作为参考点来校正 32 P掺入的偏倚至关重要，因为较长的产物将具有更多的掺入核苷酸信号，摩尔数相对于长DNA分子（Kurth等人，2013和Georgescu等人，2014）。因此，不执行此步骤的后果是对较长复制产品的过高估计，以及对较短复制产品的低估。使用以下例程量化凝胶，如Georgescu等人（1c）图1c所示。

从使用ImageJ的凝胶扫描中提取车道强度分布（，即平均像素强度与垂直距离）。
1. 水平旋转凝胶，使车道从左到右。图像＆gt;变换＆gt;向右旋转90°。
2. 选择ImageJ工具栏上的矩形图标，并在第一个通道周围制作一个矩形。
3. 绘制积分强度分布（平均强度a.u.对距离（厘米））。分析＆gt;绘图配置文件（或Ctrl + K）。
4. 将出现一个新窗口。单击保存将配置文件另存为文本文件。
5. 使用向下箭头将矩形向下移动到下一个车道，并重复步骤1c。保持相同的矩形尺寸和水平位置确保凝胶泳道正确排列。
6. 将强度配置文件作为制表符分隔数据导入电子表格软件。
将强度分布中的距离转换为DNA长度。
1. 以分子量（MW）标准拟合车道，其概率分布包含与出现在DNA MW标准中的条带数相同的高斯峰数。
2. 绘制dsDNA标准（bp）的长度与从高斯拟合得到的平均垂直距离（cm），并用对数函数拟合数据，注意拟合线的方程式。
3. 在电子表格中，使用数据分析步骤1c中获得的公式将垂直距离（cm）转换为DNA（bp）。
校正分子量的泳道强度分布。通过将每个强度值除以其DNA长度（如步骤2中确定）并乘以完整模板长度（以bp计），逐个像素地归一化产品的强度。所得到的曲线可以与任何能够进行非线性曲线拟合的软件曲线拟合，并根据需要逐个分析。

笔记

在准备3nbf底物时，至关重要的是消除所有潜在的终端标记来源，包括由于低效的叉连接引起的模板和襟翼的缺口。因此，我们建议极其温和地处理模板，包括最小的涡旋，温和的移液，等。
在叉式连接步骤期间的扩展连接是有用的。末端标记呈现出在复制分析的早期时间点出现的全长带;如果衬底已被正确准备，则应该不存在或只能稍微检测。作为对照，进行缺乏CMG和/或ATP的反应来评估终端标记的程度;没有CMG展开活动，任何时候都不应该出现全长的产品，因为Polε不能变换。
当复制测定降解底物并且也有助于终止标记时，核酸酶构成重要的问题，如果信号强度太高，其可能与全长引物延伸无法区分。因此，检查核酸酶的所有蛋白质制剂和试剂是至关重要的。微生物污染是引入核酸酶的另一个主要原因，因此确保所有试剂均经过高压灭菌，过滤灭菌，等分以供单次使用，并冷冻。有可用于测试DNAse和RNAse活性的商业试剂盒，然而，您感兴趣的试剂与 32 P标记的寡核苷酸（例如为3kbf创建的引物）的孵育时间也将提供信息。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，核酸酶活性将显示为 32 P信号的时间依赖性消失。

食谱

注意：除非另有说明，将所有溶液储存在-20°C。复制测定中使用的缓冲液不应超过〜6周。

6x凝胶负载染料
60％甘油
0.1％溴酚蓝
0.1％二甲苯甲醇
存储在RT
TE缓冲液，pH 8.0
10mM Tris-HCl，pH8.0
1mM EDTA（乙二胺四乙酸，二钠盐）
10倍TBE
1 M Tris碱
1 M硼酸
20 mM EDTA
DNA洗脱缓冲液
100 mM NaCl
10mM Tris-HCl，pH8.0
1 mM EDTA
20x SSC
3 M NaCl
0.3 M柠檬酸钠
1-丁醇饱和水
50ml 1-丁醇
5毫升ddH 2 O
大力摇动并在4°C储存
5x TDBG
125mM Tris-乙酸盐，pH7.5
25％甘油
200μg/ ml BSA
10mM TCEP（Tris（2-羧乙基）膦）pH7.5
15 mM DTT
0.5mM EDTA（乙二胺四乙酸）
10x MK
500 mM谷氨酸钾
100 mM醋酸镁
dA / dC mix
10 mM dATP
10 mM dCTP
10mM Tris-HCl，pH7.5
1 mM EDTA
dT / dG mix
10 mM dTTP
10 mM dGTP
10mM Tris-HCl，pH7.5
1 mM EDTA
T / G / C mix
10 mM TTP
10 mM GTP
10 mM CTP
10mM Tris-HCl，pH7.5
1 mM EDTA
停止解决方案
1％SDS
40 mM EDTA
10％甘油
0.02％溴酚蓝
0.02％二甲苯甲醇
存储在RT
碱性运行缓冲器
1.125 mM EDTA
30 mM NaOH

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院（T32 CA009673至G.S; R01 GM115809和霍华德休斯医学研究所对M.O.D.）的资助。本文中的方案适用于Georgescu等人，2014年，Georgescu等人，2015年和Schauer等人最初使用的方案。，2017年。

参考

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