材料和试剂

用于粘附细胞的哺乳动物细胞培养容器（100和60mm培养皿和T-75烧瓶）
100毫米培养皿（SARSTEDT，目录号：83.3902）
60毫米培养皿（SARSTEDT，目录号：83.3901）
T-75烧瓶（Corning，目录号：430641）
注意：
1. 但是，适用于您的细胞系的任何其他培养皿或烧瓶都可能会起作用。
2. 请注意，您可以在贴壁细胞的容器中生长悬浮细胞。
Eppendorf管
将适应流式细胞仪的FACS管：
Falcon 5毫升聚苯乙烯圆底管（Corning，Falcon ®，目录号：352058）
显微镜幻灯片（UltiDent Scientific，目录号：170-7107A）
注意：可以使用任何适合显微镜的显微镜载玻片。
盖玻璃（UltiDent Scientific，目录号：170-C1818）
注意：可以使用任何盖玻片。最好的保护眼镜是＃1.5，但如果不需要高质量的图像（例如共聚焦显微镜），则可以使用＃1.0或＃0。
黑色透明平底96孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo ScientificTM，目录号：165305）
哺乳动物贴壁细胞，例如HeLa，HEK293和TOV112D
注意：可以使用诸如HL60和K562之类的悬浮细胞，尽管协议需要调整。
需要完整的培养基
1. DMEM（WISENT，目录号：319-005-EL）
2. 1x RPMI 1640（WISENT，目录号：350-000-CL）
3. 卵巢表面上皮（OSE）（WISENT，目录号：316-030-CL）
注意：我们根据细胞系使用上述生长培养基。验证细胞系供应商确定细胞和必需补充剂的最佳生长培养基。
1. 胎牛血清（FBS）（WISENT，目录号：095150）
  注意：通常使用10％，但一些细胞系将需要不同的浓度。请与您的细胞系供应商联系。
2. 青霉素/链霉素（WISENT，目录号：450-201-EL）
  注意：它通常作为100x库存提供，因此必须在DMEM和RPMI1640中以1:100稀释。
3. 硫酸庆大霉素50 mg / ml溶液（WISENT，目录号：450-135-XL）以1,000倍提供，必须在培养基中稀释1：1,000;
4. 在OSE中使用0.5μg/ ml的两性霉素B（Sigma-Aldrich，目录号：A4888）
  注意：我们通常准备250μg/ ml的储备液，并加入1ml至500ml的OSE。
胰蛋白酶（PBS中为0.05％或0.25％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200072）
柔红霉素
注意：
1. 药房（Maisonneuve-Rosemont Hospital）提供，但可以从Sigma（Sigma-Aldrich，目录号：30450）购买。在无菌水中以5mg / ml制备，最终摩尔浓度为8.87mM。/ / em>
2. 柔红霉素可以被多柔比星代替（Sigma-Aldrich，目录号：D1515）。
4％多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）在PBS中的溶液
带DAPI的安装介质（Vectashield，Vector Laboratories，目录号：H-1200）
注意：该组分可以被含有1至10μg/ ml Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）的50％甘油（Bio Basic，目录号：GB0232）替代， / em> ，目录号：H1399）。
指甲油
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
氯化钠（NaCl）（WISENT，目录号：600-082-IK）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Bio Basic，目录号：S0404）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Bio Basic，目录号：PB0445）
摄取缓冲液（请参阅食谱）
氯化钠（NaCl）（WISENT，目录号：600-082-IK）
HEPES pH 7.4（Bio Basic，目录号：HB0265）
葡萄糖（WISENT，目录号：600-350-IK）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Bio Basic，目录号：PB0445）
氯化钙（CaCl 2）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
硫酸镁（MgSO 4）（Bio Basic，目录号：MN1988）

设备

移液器（任何移液器都可以）
孵化器（任何孵化器如果保持5％CO 2 和湿气）就可以使用
pH计（任何pH计将工作）
Eppendorf离心机（任何可适应1.5 ml微量离心管的离心机）
血细胞计数器（任何血细胞计数器都可以）
流式细胞仪（FACS）
注意：该协议正在使用Becton-Dickson的FACS Calibur（BD，型号：FACS Calibur TM ）。
荧光显微镜（Olympus，型号：BX53）
注意：我们使用奥林巴斯BX53，但是可以使用具有所需过滤器组件的任何荧光显微镜（请参见过程D中所需的过滤器）。
Fluoroskan Ascent（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Fluoroskan Ascent TM ）

软件

ImageJ
注意：我们在美国国立卫生研究院网站上使用了一个; https://imagej.nih.gov/ij/ 。
CellQuest Pro版本4.0.1＆copy; 1994-2001 BDB或5.2.1＆copy; 1994-2005 BD

程序

细胞的制备
1. 在37℃，5％CO 2，95％空气中培养推荐的培养基中感兴趣的细胞。
2. 在实验前一天，从细胞中取出培养基并用PBS洗涤（参见食谱）。加入适量体积的胰蛋白酶（100毫升培养皿或T-75烧瓶1-2毫升）。在37℃下孵育2至15分钟。
  注意：孵育时间因细胞系而异。孵化，直到看到细胞从表面上脱落。
3. 向细胞添加完整的培养基以抑制胰蛋白酶。
  注意：要添加到单元格的媒体的音量取决于要创建的样本数。请记住，您必须将此卷除以您要创建的样本数。
4. 将细胞移入60毫升培养皿中，总共约5至6毫升培养基。
  注意：
  1. 所需板数取决于您要执行的实验种类。您总是需要至少一个Petri平板进行阴性对照，但最好将所有样品一式三份。每个时间点或三个板块需要三块板，以测试每种柔红霉素浓度。
  2. 你必须种细胞，所以在实验当天的汇合率低于50％，因为更高的汇合会人为地减少柔红霉素摄入。
5. 在37℃，5％CO 2，95％空气中孵育细胞。
用柔红霉素治疗细胞
1. 从细胞中取出培养基。
  注意：细胞可以洗涤，但这似乎并不影响整体效果。然而，如果在柔红霉素治疗之前用另外的化合物处理细胞，则应添加具有UB的洗涤步骤。
2. 向细胞中加入5ml UB。
3. 在37℃，5％CO 2，95％空气中孵育至少5分钟。
4. 通过将8.87mM的库存浓度稀释35倍，在UB中准备浓度为255μM的柔红霉素稀释度。
5. 向5ml的UB中加入100μl的25μM柔红霉素，使终浓度为5μM。
  注意：
  1. 为了测试不同浓度的柔红霉素，请记住所需的稀释的柔红霉素体积，以调整添加到细胞中的UB的体积。尝试各种浓度可能是一件好事，以确定您的实验的最佳浓度。参考浓度应为5μM。
  2. 请记住，您将需要一个未处理的细胞样本进行所有操作。
6. 将细胞在37℃，5％CO 2，95％空气中孵育所需时间。
  注意：在几分钟后可以检测到柔红霉素摄取，但较长的暴露时间可能会增加样品之间的差异。因此，为了确定实验的最佳时间点，可能需要时间依赖的曲线。 30到60分钟之间的曝光时间将是最佳起点。
7. 一旦在37℃下孵育完成，根据细胞类型，它们可能开始从板上脱离。如果是这种情况，通过上下移液来收集细胞，以将所有细胞分离并放入Eppendorf管中。使用任何标准的Eppendorf离心机将细胞以5,000×g /孔分散1分钟，并除去上清液。用1ml冷PBS洗涤细胞。
  注意：如果细胞未与板分离，则取出含有柔红霉素的UB，并用冷PBS洗涤细胞。加入0.5ml胰蛋白酶，等待细胞分离。加入0.5ml冷PBS，并将所有细胞收集在Eppendorf管中，并以5000xg离心1分钟。去除上清液。
8. 向细胞沉淀中加入100μl的4％PFA，并在室温下孵育10分钟或在4℃下孵育60分钟。
9. 离心5000 x g 1分钟，取出上清液。
10. 加入100μlPBS。
  注意：从这一点上，您可以进入程序C（FACS分析），程序D（荧光显微镜检查）或程序E（Fluoroskan分析）。
处理细胞的FACS分析（需要大约100,000个细胞进行分析）
1. 对每个样品取一个FACS管，并在每个管中放入250-500μlPBS。
  注意：你放在管中的PBS量取决于你拥有的单元格数量。更多的PBS，你需要更多的时间来达到FACS所需的事件数量。但是，您需要足够的音量才能在机器上进行调整。
2. 将方法B中制备的细胞加入FACS管中的PBS。
  注意：您可以随时保留一些细胞悬浮液，以分别执行程序D和程序E中的分光荧光显微镜和Fluoroskan分析，但这取决于程序B中细胞颗粒的大小。请记住，如果FACS管中的细胞较少，则需要更长时间才能读取10,000个事件。
3. 打开FACS和计算机，并确保阀门关闭，以便FACS Flow罐受到压力。
  这些坦克在机器的“抽屉”中。有两个坦克，正确的是FACS Flow，左边是一个垃圾。阀门位于油箱之间。
4. 打开FACS的软件（这里我们使用的是CellQuest Pro）。
5. 转到“获取”标签，然后点击“连接到细胞仪”（图1）。
  
  图1.显示将细胞仪连接到计算机的显示
6. 输入每个所需检测器的名称。使用P4（FL2 585/42）进行柔红霉素检测（图2）
  
  图2.显示浏览器。输入每个使用的检测器的名称。
7. 选择要保存数据的文件夹，方法是单击第一个“更改”（图3）。
  
  图3.在浏览器中显示目录。选择将包含实验文件的所有文件。
8. 绘制点图或密度图，并更改“绘图类型”以获取分析（图4）。
  
  图4.绘制创作。确保更改绘图类型。
9. 点击“编辑”选项卡和“复制”创建另一个图形。在第二个图表上，将x轴名称更改为柔红霉素。
  注意：这就像做“复制/粘贴”，但是它不能在CellQuest Pro中复制图形，这就是为什么必须使用“重复”功能的原因。图形也可以逐个创建，但这需要每次更改“绘图类型”。
10. 在“细胞计数器”选项卡中，单击“检测器/安培”。将荧光灯更改为“日志”模式（图5）。
  
  图5.显示检测器控件。更改刻度类型并调整检测器的电压。
11. 点击象限工具，并在柔红霉素图中创建象限，将垂直线放置在10左右，水平线绕图形中间（图6）。
  这些将构成阈值。如果需要，您可以根据样品更改这些设置。
  
  图6.显示象限。实验的阈值。
12. 点击“统计”标签和“象限统计”（图7）。
  如果您返回到“统计”选项卡（图7），您可以编辑象限统计信息。
  
  图7.显示和编辑象限统计信息
13. 从机器上取下任何管，然后按'Prime'。一旦按钮的指示灯熄灭，再按一次。
14. 将一个阴性对照管放在机器上，按'Run'。
15. 确保选中“设置”复选框，然后单击“获取”（图8）。
  
  图8.“设置”模式下的浏览器。这可以让您分析单元格而不保存任何数据。
16. 更改检测器的电压，使几乎所有的单元格都位于左下象限中。（图9）
  注意：
  1. 使用SSC作为y轴，放置象限的水平线，以排除具有很高死亡细胞机率的非常高的SSC值的细胞。因此，上方的象限将排除死细胞。
  2. 从分析中排除死细胞的另一个选择是在显示单元格（P1和P2）的FSC和SSC的图形上创建一个门。死细胞将具有非常低的FSC和高SSC。为此，在FSC-SSC图上，使用门工具选择活细胞群体。在柔红霉素图的菜单中，转到“门”，选择“R1”或相应的门。
  图9.调整检测器电压
17. 点击“设置”复选框，在样本文本框中删除检查并写入第一个样本的名称（图10）。
  您还可以使用病人文本框来写入不会经常更改的名称的一部分。例如，如果您使用两个细胞系执行时间依赖曲线，请在患者文本框中填写细胞系名称，并在样本文本框中写入时间点（图10）。
  
  图10.准备收购
18. 将要分析的样品放在机器上，然后单击“Acquire”（图11）。
  您可以通过在“获取”选项卡中显示“计数器”窗口来查看每秒事件数和总事件数。机器的速度可以从慢到中，直接在机器上改变。每秒钟有1,000个事件是最好的。
  
  图11.获取
19. 更换您的管并重复所有样品的采集。
20. 一旦您分析了所有的样品，您可以通过点击图表将它们显示在图形中，然后在“绘图”选项卡中，您可以更改显示的数据（图12）。
  
  图12.样本之间的导航
21. 要分析数据，将右下象限中的平均柔红霉素荧光乘以象限统计窗口中显示的象限中的细胞百分比（图13）。
  
  图13.计算样品的平均荧光
  
  注意：如果您使用用荧光标记物转染的细胞系，例如，研究用GFP标记的特定蛋白质的过度表达的影响，则创建另一个图形并改变该图的x轴（FL1 530 / 30）。使用门控工具创建门，仅使用未转染细胞样本的GFP阳性细胞作为阴性对照来设置阈值。接下来，在显示柔红霉素荧光的图表的菜单中，转到Gate并选择R1。这样，显示柔红霉素的图只显示GFP阳性细胞。如果您进行瞬时转染，这可能非常有用。但是，您可能需要增加在柔红霉素图中获得足够GFP阳性细胞的事件数。为此，请访问“获取”选项卡，然后单击获取和存储。在那里你可以设置偶数。在FL2检测器上可能会出现GFP泄漏，因此使用P5（FL3）可能是一个选项。您还可以使用细胞计数器选项卡中的补偿菜单来降低GFP对FL2的影响，以及柔红霉素对F1的影响。
荧光显微镜检查
1. 在显微镜载玻片上放置3μl带有DAPI的固定介质。
  注意：使用DAPI的固定介质可以用含有1〜10μg/ ml Hoechst 33342的50％甘油溶液代替。
2. 从程序B中加入2μl细胞悬液
3. 在样品上盖上盖子并用指甲油固定。
  注意：幻灯片可以在黑暗中4°C储存一到两周。
4. 使用DAPI过滤器，用荧光显微镜观察细胞，使细胞核和红色滤光片（德克萨斯红）可视化为柔红霉素60倍或100倍。
  注意：这里的协议描述了在Microsystems上工作的奥林巴斯B53直立荧光显微镜的程序。
  1. DAPI过滤器也用于染色Hoechst 33342。
  2. 为了可视化柔红霉素，您必须激发从480 nm到560 nm的波长。通过FITC或Texas RED滤波器的激励应该起作用。柔红霉素的发射可以从575 nm到680 nm（德克萨斯州红/麦克滤光片）检测。使用Texas RED滤波器组将是最好的，否则可能需要不同的发射和激发滤波器。
5. 使用对照样品，设置光强度和曝光时间，使柔红霉素清晰可见但不饱和（图14）。
  
  图14.要获取的图像示例
6. 要调整光线强度，请使用与显微镜相连的灯具
7. 曝光时间的调整在“曝光窗口”中的计算机上进行（图15）要以定量方式使用此方法，您不得更改这些daunorubicin可视化参数。
  
  图15.调整曝光时间
8. 调整这些参数（光强度和曝光时间）也适用于核这些设置可以从一个样品更改为另一个样品，除非您想要研究染色质本身。 DAPI或Hoechst对染色质的染色可能会被大量DNR污染到DNA上。
9. 如果使用GFP或其他颜色，请设置此颜色的光强度和曝光时间。
10. 拍摄所有样品的所有颜色的照片。为此，您必须单击“捕捉”（图16）。
  
  图16.相机控件。捕捉以拍摄照片。
11. 您可以通过点击图片上方的标签，在您拍摄的照片之间导航（图17）。
  注意：
  1. “实时”选项卡可让您看到显微镜上的内容。要显示它，如果不是，请点击实时按钮。
  2. 重要提示：显微镜具有“模式”，因此可以通过眼睛，相机或两者显示。拍照时，请确认“模式”是使用相机。在奥林巴斯B53上，可以通过拉或拉金属棒在眼睛右侧。
  3. 一些显微镜如ZEISS Z2使用专门的软件，也可以用来编辑图片以创建具有颜色和合并图片的TIFF文件。
  图17.图片之间的导航
12. 保存所有可以用ImageJ处理的图像。
13. 打开ImageJ软件并点击文件＆gt;打开图像。打开单个样品的所有颜色（图18）。
  
  图18.在“文件”中打开图片
14. 点击图片，然后转到“图像”＆gt;渠道工具（图19）
  
  图19.打开“渠道工具”
15. 在频道窗口中，点击“更多”，然后点击所选图片所需的颜色。将颜色应用于所有图片（图20）。
  
  图20.将颜色应用于图片
16. 点击“合并通道”，并为每种颜色选择所需的图片。点击“确定”（图21）。
  如果您不希望软件关闭所有打开的图片，请确保勾选“保留源图像”复选框（图21）。
17. 您现在可以按照所需的文件类型“保存为”所有图片：TIFF，JPEG，等。
  
  图21.合并图像
氟碳分析
1. 将细胞悬浮液从步骤B 1:10稀释至1:100，具体取决于细胞密度。
2. 将10μl稀释液放在血细胞计数器上，并计数25个中央正方形中的细胞数，并将数乘以20,000。
3. 然后乘以稀释因子获得的数目，以获得细胞悬浮液中每毫升的细胞数。
  注意：对于要分析的每个样品，请执行此操作。
4. 在黑色透明的平底96孔板中，放入6,000至20,000个细胞，并将每个孔中的体积用PBS填充至100μl。每个井必须具有相同数量的细胞。
  注意：建议对样品进行一式三份的分析。
5. 将盘子放在Fluoroskan读板器上。
  注意：确保卸下96孔板的盖子。
6. 点击“Measure1”（图22）。
  
  图22.打开“Measure1”窗口
7. 选择波长对544/590（图23）
  
  图23.选择正确的波长对
8. 点击“Shake1”（图24）
  
  图24.打开“Shake1”窗口
9. 设置30秒的时间和不超过900 rpm的速度（图25）。
  
  图25.摇动样品的设置。不要太快！
10. 点击“常规”（图26）。
  
  图26.打开“常规”窗口
11. 点击“区域定义”选项卡，然后通过将鼠标拖到其上来选择要读取的孔（图27）
  
  图27.区域设置
  
  要清除井，请确保点击红色井图标。要添加井，请确保点击绿色井图标（图28）。
  
  图28.区域设置控件
12. 点击“布局”（图29）。通过将鼠标拖动到井上，清除屏幕上的任何布局，然后单击“清除”（图29）。在“Type”中选择“BLANK”（图29），然后选择包含未处理样品的孔。点击“应用”（图29）。
13. 将“类型”更改为“样品”，并选择所有含有处理过的细胞的孔。点击“应用”（图29）。
  
  图29.设置布局
14. 点击开始按钮（图30）。
  
  图30.阅读您的样本

数据分析

对于方法C（FACS分析）和方法E（Fluoroskan分析），计算是直接的，其涉及取每个程序结束时获得的值并确定平均值和标准偏差。使用参考样本并以其他百分比表示其他人是一个好主意，特别是如果需要比较不同的实验（图31）。

图31.绘制FACS结果使用样品“处理1”作为参考样品，调整至100％，样品“处理2”相对于该参考文献表示。该图显示，样品“处理2”比参考样品多占20％的药物。
注意：图31中的空白样本不需要绝对为零，但其值必须可忽略。调整DNR检测器的电压，使> 95％的空白单元格在行左边（图9）。建议从所有其他值（例如，零时间点）中减去空白值。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（1L）
8克NaCl
0.2 g mM KCl
1.44g mM Na 2 HPO 4
0.24g mM KH 2 PO 4
吸收缓冲液pH 7.4（100ml）
12.5 ml 1M NaCl 2.0ml 0.5M HEPES pH 7.4
0.6 ml 1 M葡萄糖
0.5 ml 1M KCl 0.6ml 0.2M KH 2 PO 4
0.1 1M CaCl 2
0.6ml 0.2M MgSO 4

致谢

这项工作由研究资助MOP-93573资助给D.R.来自加拿大卫生研究所。我们感谢Mikhail Sergeev博士向显微镜和Martine Dupuis提供与FACS技术指导的技术指导。以前描述了该协议的简要版本（Andreev等人，2016）。

参考

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