材料和试剂

移液器提示（LTS提示1,000μl，250μl，20μl，Mettler-Toledo，Rainin，目录号：GPS-L1000，GPS-L250和GPS-L10）
管（Axygen Microtubes 1.5ml透明，均聚物，防沸腾）（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
将一次性无菌塑料15ml（Corning，Falcon ，目录号：352099）和50ml（Corning，Falcon，目录号：352098）锥形离心管>
一次性玻璃试管（20 x 150 mm）（Fisher Scientific，目录号：14-958K）
Kimble Kim-Kap试管封闭件（Fisher Scientific，目录号：14-957-91C）
制造商：DWK Life Sciences，Kimble ® ，目录号码：7366020。
塑料培养皿（100 x 15毫米尺寸）（VWR，目录号：25384-088）
0.5毫米玻璃珠（Bio Spec Products，目录号：11079105）
酵母菌株
1. SF838-1Dα（MATLAB ura3-52 leu2-3,122 his4-519 ade6 pep4-3 gal2）（俄勒冈大学; Rothman和Stevens，1986）
2. 用于体内质粒装配和回收的THS4218（SF838-1Dα; HIS4his3Δ:: Hyg R ）（加利福尼亚大学伯克利分校; Finnigan和Thorner，2015）
3. 用于构建所有酵母的BY4741（MATαhis3Δ1ura3Δ0leu2Δ0met15Δ0）（加利福尼亚大学伯克利分校; Brachmann等人，1998）菌株测试了
单击® TOP10具有化学能力。（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：C404003）
注意：参见（Finnigan和Thorner，2015），用于繁殖和制备TOP10种子培养物。
含有prGalL-Cas9-CYC1（t）的质粒用作构建含Cas9的盒的模板DNA（Addcene，目录号：43804）（DiCarlo等人，2013）
含有prSNR52-sgRNA-SUP4（t）的质粒（Addcene，目录号：43803;由Genscript合成）（DiCarlo等人，2013）
ssDNA：来自鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐（煮沸10分钟，并在每次使用10mg / ml水溶液前在冰上冷却）（Sigma-Aldrich，目录号：D1626）
（25mg / ml）（Amsbio，目录号：120493-1）在50％甘油储备液（经认证的ACS级）（Fisher Scientific，Inc。）中的酵母菌素<100>目录号：G33）
适当的限制酶用于消化
1. I-HF（New England Biolabs，目录号：R3189）
2. I（New England Biolabs，目录号：R0176）
3. HI-HF（New England Biolabs，目录号：R3136）
4. Xho I（New England Biolabs，目录号：R0146）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28706）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202）
GeneJET质粒微量稀释试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：K0503）
KOD热启动DNA聚合酶（EMD Millipore，目录号：71086-3，由VWR分发，目录号：80511-384）
定制DNA寡核苷酸引物（25-100nmol浓度; Integrated DNA Technologies）
GeneJet PCR纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：K0701）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E8751）
琼脂糖粉末（美国生物技术公司，目录号：G01PD-500）
以300μg/ ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10687010）使用的潮霉素
以200μg/ ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11811031）使用的G418硫酸盐（遗传霉素），
D-（+） - 五水合棉子糖（20％储存于水中，过滤灭菌，不经高压灭菌）（Sigma-Aldrich，目录号：R7630）。使用一次性硝酸纤维素过滤器（0.2μm过滤器尺寸）过滤（Corning，目录号：430186）
蔗糖（20％储存在水中，过滤灭菌，不经高压灭菌）（Fisher Scientific，目录号：S3）
1M乙酸锂二水合物（CH 3 CO 2•2H 2 O，试剂级）（Sigma-Aldrich，目录号：L6883）
50％PEG：聚（乙二醇），BioXtra平均分子量3,350（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
氨苄青霉素（终浓度为100μg/ ml）（RPI，目录号：A40040-100.0）
卡那霉素（终浓度为50μg/ ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11815024）
酵母提取物（BD，Bacto TM ，目录号：212750）
蛋白胨（BD，Bacto TM ，目录号：211677）
右旋糖（20％储存在水中）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D16）
D-（+） - 半乳糖（20％储存在水中，过滤灭菌，不经高压灭菌）（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）
Tryptone（BD，Bacto TM ，目录号：211705）
氯化钠（NaCl，认证ACS等级≥99.0％）（Fisher Scientific，目录号：S271）
氯化钾（KCl，BioXtra≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯化镁六水合物（MgCl 2•6H 2 O，BioXtra≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
硫酸镁溶液（分子生物学级别的MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M3409）
超纯琼脂，细菌级（美国生物技术资料公司，目录号：A01PD-500）
酵母氮碱减去氨基酸和负硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：Y1251）
硫酸铵（（NH 4）2 SO 4认证的ACS等级≥99.0％）（Fisher Scientific，目录号：A702）
“几乎完全”的氨基酸混合物
腺嘌呤HCl（Sigma-Aldrich，目录号：A9795），20mg / L
精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5131），20mg / L
酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T3754），30mg / L
异亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：I2752），30mg / L
苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2126），50mg / L
谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G1251），100mg / L 天门冬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9256），100mg / L 苏氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8625），200mg / L
丝氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：S4500），400mg / L
缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V0500），150mg / L
甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5626）
组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H8125）
亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8000）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich，目录号：U0750）
5-氟尿酸（5-FOA）（Oakwood Products，目录号：003234）
氢氧化钠（NaOH认证ACS等级≥97.0％）（Fisher Scientific，目录号：S318）
三碱基，分子生物学等级≥99.8％（Fisher Scientific，目录号：BP152）
冰醋酸（认证ACS级）（Fisher Scientific，目录号：A38）
乙二胺四乙酸（EDTA 99％-101％）（Fisher Scientific，目录号：S311）
超纯无菌水（Millipore Sigma，Milli-Q水净化系统）
YPD液体介质（见配方）
YPGal（见配方）
SOC介质（参见食谱）
YPD板（适当的药物可选）（见配方）
合成辍学板/媒体（见配方）
5-FOA板（参见食谱）
LB平板（含适当药物）（见食谱）
TAE缓冲区（见配方）

设备

移液器（Rainin，Pipet-Lite LTS，1,000μl，250μl，20μl和2μl大小）
PCR机（MJ Research PTC-200Peltier Thermo Cycler，双30孔α嵌段）（MJ Research，型号：PTC-200）
离心机（Eppendorf微量离心机）（Eppendorf，型号：5415D，目录号：022621408）
Eppendorf转子（24 x 1.5 / 2 ml）（Eppendorf型号：F-45-24-11，目录号：022636502）
涡旋适配器（Fisher Vortex Genie 2混合器的Microtube泡沫插入件）（Scientific Industries，型号：Vortex Genie 2，目录号：504-0234-00）
制冰机（Hoshizaki American）
水浴（Thermomix循环水浴，型号B，852 013/5型）
DNA凝胶电泳仪（HE 33 Mini Submarine Unit）（GE Healthcare，目录号：80-6052-45）
ChemiDoc UV透射仪（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc TM XS +，目录号：1708265）
孵化器旋转器（Labquake摇床）（Labindustries，型号：T-415-110）
孵化器（VWR，型号：Model 1535）
高压灭菌器（加利福尼亚大学巴克厅）

程序

这里我们描述了用于设计，构建，整合和编辑酵母基因组中的Cas9人工靶序列的策略。我们重点关注如何精确安装编程的目标位点的克隆方法（其他方法可能在某些步骤中被替代，我们强调这些），并与Cas9 体内复用。我们详细说明了我们发表的（Finnigan和Thorner，2016）概念证明，描述了使用基本和非必需基因以及Cas9基因本身的方法来说明这种方法的效用和功能。

人造地点的选择
1. 首先，必须选择与选择的生物体（发芽酵母基因组）具有最大不匹配的至少23bp（20个靶标+ 3个Protospacer相邻基序[PAM]）的唯一靶序列（称为“[u1]”））和系统的所有其他外生成分（添加的载体，GFP，药物盒，标签，等等）。所选择的序列可以来自另一个生物体（在我们的例子中，选择了两个人基因序列），或者可以从新生成生成。
  注意：其他研究已经发现了靶序列（和PAM）的各种限制。推荐（在酵母中）不具有poly-T序列（五个或更多个），因为它代表RNA Pol III的终止信号（DiCarlo等，2013）。另外，不推荐使用极端AT或GC丰富的序列。
2. 应使用NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）。应首先搜索3'最多15 bp（包括PAM）的初步筛选。这表示Cas9 / sgRNA复合物使用的“种子”区域，其首先与推定的匹配的基因组靶序列相关联（Jinek et al。，2012; DiCarlo等人。，2013; Jiang等人，2013）。应确定这些碱基之间的最大不匹配，特别强调PAM序列的GG碱基内的错配。一旦发现了推定的靶标，就可以对酵母基因组询问整个23bp序列的全面搜索，同样偏好高水平的错配。
  注意：如果将人造目标包含在开放阅读框内（并作为附加的N-和/或C-terminal标签转换），则应包括额外的基数（23 + 1）以保持序列在帧内。此外，应避免在序列内发生任何帧内终止密码子。

标记基因，Cas9和sgRNA质粒的构建

在选择独特的[u1，u2，u3 ...]人造位点（方法A）之后，以及在所述位点（图1，底部），体内质粒组装（Finnigan and Thorner，2015）可用于将位点安装在其精确位置。
注意：我们以前描述了质粒“体内连接”的整个过程，然后从酵母中回收构建的载体（Finnigan and Thorner，2015）。我们将包括与原始协议有关的相关修改的附加注释/步骤。

图1.在芽殖酵母中Cas9多态基因编辑的人造DNA序列的设计，构建和使用。热门。工作流概述。该方案开始于人造DNA Cas9靶位点的选择，随后构建包含Cas9和sgRNA表达盒的所需质粒。接下来，进入酵母基因组的连续整合事件将目标位点放置在包括Cas9在内的多个位点。在Cas9存在下转化sgRNA质粒和扩增的供体DNA片段允许在体内编辑。最后，通过诊断PCR和DNA测序验证基因组，证实了预期的修改。底部。在三个位点（其中一个包括Cas9）含有六个相同[u1]（独特工程序列）位点的实例基因组。在Cdc11（单个红色星号）的N-和C-末端附有24bp序列（20个靶标+ 3个PAM + 1个额外碱基）作为8个残基标签。在缺失的GeneY（Shs1）的情况下，添加的[u1]位点（23bp）是UTR的一部分（两个红色星号）。仅使用一种sgRNA可以在所有六个基因组位置上形成双链断裂（DSB）。与UTR具有侧翼同源性的相应的扩增供体DNA的存在（为了清楚而仅示出一个）允许通过同源重组同时进行多基因标记的整合事件。根据Cas9基因侧翼的人工位点[u1或u2]的身份，可以根据给定菌株未来编辑事件的需要，实现Cas9的伴随或连续切除。
寡核苷酸的设计应包括预期的23（或24）bp人工序列，并将其置于框内作为待标记基因的一部分，或通过两步PCR扩增置于侧翼UTR内。如图2所示，我们描述了给定基因的N-和C-末端两个相同的[u1]标签的构建过程。然而，我们选择将每个标签的包含分成两个并行构建的中间质粒。如果使用单个质粒组装过程，则含有预期的[u1]序列的PCR片段之间将存在竞争;可能的是，不是将WT基因包括在两个人造部位之间，而是可能导致排除中心片段，并且仅产生单个[u1]位点。为了消除这种可能性，我们分别构建了每个[u1]序列。这可能在其他应用中有用，其中基因可能有意地位于两个不同的人造位点的两侧

图2.含有侧翼独特序列位点的样品基因的质粒装配[u1]。 1。在酵母中使用体内质粒组装（Finnigan and Thorner，2015），将一个人工位点[u1]插入到通用启动子（prGeneX）和样品基因（GeneX）的开放读框之间。该策略也可以应用于使用MX盒（Goldstein和McCusker，1999）或任何开发的遗传等位基因的基因的缺失。插入的[u1]序列包括在两个重叠的寡核苷酸之内，这些寡核苷酸允许在组装的质粒中包含所需的靶向靶标。所示的示例包括使用 S。 pombe HIS5 MX盒式磁带;质粒再循环的选择也是足够的。也使用体内连接构建类似的质粒，其在基因的最后一个密码子（如图所示）和天然终止子序列的上游插入[u1]位点。为了选择目的，还包括了ADH1 -MX磁带。每个产生的质粒用作两个PCR的模板，其中两个相同的[u1]位点在适当的位置;片段之间产生的重叠同源性跨越了样本基因的整个开放阅读框架（如图所示）。 4.新设计的盒可以通过PCR扩增，并包含两个[u1]位点以及5'和3'UTR序列（也分别称为prGeneX和GeneX（t））侧翼的基因）整合（见图4）
在成功构建两个单独的[u1]标记序列之后，应使用来自每个原始载体的扩增产物进行第二轮装配。在这种情况下，虽然[u1]可以在技术上提供23（或24）bp的重叠同源性，但是全基因的整体提供> 1,200 bp的同源性，极大地偏倚了该序列内发生的交叉，并使组装倾向偏移，包括[u1]位点以及中心基因。使用侧翼[u1]位点构建CDC11 （WT基因）和SHS1（删除盒）两者。
注意：该过程也可以使用缺失盒而不是基因的WT编码序列来实现。如果标记的盒子包括可选标记，则可以在单个步骤中进行构建，因为主动选择将确保[u1]位点以及删除标记物的存在。
对于Cas9表达盒的构建（图3），我们证明了使用由于最终目的产物的复杂性（九个单独的DNA序列组装）构建的另外的中间质粒。在单个质粒组合物插入[u1]（显示）或[u2]靶位点之后，第一中间体在诱导型启动子和通用终止子之间产生具有唯一限制性位点（ I）的载体序列。另外一轮的体内组装允许包含Cas9基因（两个扩增片段，从Addgene质粒＃43804扩增）和C末端NLS序列。
注意：该中间整合载体（图3，＃3）将允许将任何Cas9直向同源物快速包含到酵母中的[u1]或[u2]含HIS3基因座中。

图3. Cas9表达盒的质粒组装1.与样品基因周围的侧翼[u1]位点的组装相似（图2），构建[u1]或[u2]侧翼表达盒以逐步方式（红色星号）完成。 S上。化脓性成虫Cas9受GAL1 / 10启动子的控制，并位于酵母HIS3基因的独特位点和5'UTR的下游。独特的限制性位点（RS，不是 I）被包含在起始密码子之后和在ADH1终止符序列之前。 2.将[u1]或[u2]位点置于整个MX终止子序列之后，但位于酵母HIS3 3'UTR的上游。 3.在构建每个单独的载体后，将两个片段进行PCR扩增，并使用体内结合将其合并成较大的载体以产生中间表达载体。 4.独特的不限制性酶切位点的消化可以进行质粒装配的最后一步，以插入Cas9和NLS（核定位信号），两者都以两个重叠的PCR片段在帧内与起始点扩增密码子。 5.在验证整个Cas9表达盒后，PCR扩增可以在HIS3基因座上融合到酵母基因组中（见图4）。

图4.将[u1]侧翼基因和Cas9表达盒整合到酵母基因组中。作为一个概念证明，我们选择使用两种天然酵母基因（和SHS1 ）在酵母中试验这种方法，并将Cas9集成到一个安全的-harbor（HIS3 ）位点。 CDC11 是必不可少的基因，我们的策略说明了为进行基本和非必需基因的修饰和Cas9编辑而采取的其他步骤。使用表达缺少3'UTR序列的GeneX（TM119）的WT拷贝的基于URA3的覆盖载体转化WT BY4741酵母。 2.使用标准的基于MX的缺失盒删除内源GeneX拷贝，并在含有G418的培养基上进行选择。 3.将整个[u1]侧翼的GeneX构建体（图2）扩增并转化到GeneXΔ菌株中，并在含有5-FOA的培养基上选择，以反向选择基于URA3的覆盖载体。剩下的唯一可行的酵母将整合[u1]侧翼的GeneX（WT）拷贝代替Kan R 盒，导致无标记的修饰。酵母整合事件都经过每轮连续修改后的诊断性PCR和DNA测序证实。 4.在单独的GeneY基因座（ 1 ），构建了一个缺失盒，并侧接了[u1] Cas9位点（与图2中的GeneX相似的策略）并转化进入酵母以删除内源GeneY拷贝。最后，扩增整个Cas9表达盒（图3），转化成酵母，并在HIS3基因座（he3Δ1）上整合，提供菌株G418电阻。如图所示，最终菌株含有六个相同的[u1]靶位点。然而，还使用与位于Cas9盒侧面的[u1]位点不同的[u2]序列测试替代构建体，允许在HIS3 基因座处进行单独和顺序编辑。
在构建和验证所需的质粒（图2,3底）后，最终的PCR扩增允许将整个设计的盒整合到酵母基因组中（参见方法C）。
可以从质粒或染色体制剂扩增供体PCR，在DSB断裂的任一侧具有至少30bp的侧翼同源性。用作我们的概念验证的供体DNA的PCR片段（，CDC11，SHS1和HIS3 ）从分离的染色体DNA准备的WT酵母与几百个碱基的侧翼UTR序列。为了扩增WT HIS3，使用SF838-1Dα基因组DNA。
可以使用多种方案构建sgRNA表达质粒。我们的sgRNA的构建包括：
1. 在具有SNR52启动子，SUP4终止子的（DiCarlo等人，2013）之后，对sgRNA盒序列进行建模，并且包括[ u1] 20 bp靶序列和所需的结构RNA序列（79 bp）。化脓性成虫 Cas9。从Genscript（Piscataway，NJ）合成了整个盒子。
  注意：已经开发了许多方法，其允许构建包括限制性消化和连接，体内组装或吉布森克隆的sgRNA质粒（Laughery等人，2015; Ryan等人，2016）。 >
2. 侧翼限制位点应包含在合成的sgRNA盒（Finnigan和Thorner，2016）的图1C中。将我们的合成基因（Genscript）克隆到pUC57中，并含有侧翼的BamHI和XhoI位点。高拷贝的pRS425酵母质粒和[u1] sgRNA质粒应该在37℃和孵育器两端用BamHⅠ和XhoⅠ消化过夜，分离出线性化的片段在1％琼脂糖凝胶上，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）萃取。
3. 使用T4 DNA连接酶（NEB），纯化的DNA应在16℃连接16小时。通过在65℃下孵育10分钟（在PCR块中进行）停止反应。
4. 应用10μl连接反应转化100μlTOP10感受态大肠杆菌，在冰上孵育15分钟，在42℃热冲击45秒（水浴），回收到冰2分钟，轻轻混合500μlSOC培养基（参见食谱），37℃孵育1小时（慢转培养箱）。
5. 应将细胞接种在LB + AMP平板上（参见食谱），并在37℃孵育过夜。将克隆分离物在液体LB + AMP培养基（37℃水浴中过夜14-16小时）培养，并用细菌质粒提取试剂盒（GeneJet）提取质粒。 sgRNA质粒的DNA测序后的诊断性消化可用于确认从pUC57到pRS425的正确亚克隆。
6. 为了产生靶向sgRNA的质粒（除了20bp的靶序列以外，其相同），连续的修改的快速PCR（Zheng等，2004）可以是用于将[u1]序列变为[u2]。（这可以在较小的pUC57载体，然后是上述亚克隆步骤或最终的pRS425载体上实现）。简言之，应设计60 bp的寡核苷酸（正向和反向引物）互补并含有中心1-4碱基取代（变化不必是连续的，而应在相对较近的区域内）。
7. 应使用高保真KOD热启动聚合酶（EMD Millipore），推荐条件，退火温度为50°C，延长时间为40 sec / Kb，将整个载体进行PCR扩增。简单地说，将含有KOD组分（Mg 2+，1×缓冲液和1×dNTP）的50μl反应（总体积）全部提供），模板DNA（100-500ng），寡核苷酸反向，最终浓度为1μM每种引物），并且应制备1μlKOD酶。初始热启动循环（95℃，2分钟），然后循环由（i）95℃，15秒，（ii）50℃，30秒和（iii）72℃，X秒（其中X是模板质粒的总大小除以40秒/ Kb）。 16个总循环后，应包括在72°C的最后10分钟延伸时间。
8. 在DNA琼脂糖凝胶上确认后，应用37℃（培养箱），用1μl的DpnⅠ消化7.5μlPCR反应物，最终反应体积为50μl。消化与dpn I用于破坏PCR反应中的环状（甲基化）模板酵母质粒DNA，以便除去由于模板DNA而不是预期的质粒组件可能在酵母中繁殖的假阳性克隆。
9. 将2μl的经处理的消化反应的Dpn转化为E。大肠杆菌如前所述
10. 克隆分离物应通过DNA测序确认

将构建体整合到酵母基因组中

我们将[u1] / [u2]侧翼DNA序列置于酵母基因组中的策略说明了必需（CDC11）和非必需（SHS1）之间的能力，用这种方法操纵的基因（图4）。我们的逐步整合方案的变化可以使用不同的基因缺失或其他方法来实现，包括（i）将并行和随后的交配，二倍体形成和孢子形成中的分离的标记基因整合到相反的交配类型中（给定的操纵基因包括可选择的某些标记）; （ii）整合载体如pRS300系列（Sikorski和Hieter，1989）和/或（iii）CRISPR / Cas9本身以产生双链断裂，并允许以[u1] - 片段作为供体DNA插入。我们的程序说明了构建预期酵母菌株的一种可能的策略
应使用改良的乙酸锂方案（Finnigan和Thorner，2015），用保护性“覆盖载体”（URA3标记）转化WT BY4741酵母，并在SD-URA平板上选择。
应该将PCR基因（例如，，CDC11 ）的基因敲除盒（Finnigan等，2015）用PCR扩增足够的5'和3'UTR侧翼序列 - 数百个bps），在37℃下用DpnI消化过夜，转化到酵母中，并在含有G418的培养基上选择。另外，由于缺少必需基因（例如标记的覆盖质粒），对含有5-FOA的平板（对于URA3标记的覆盖质粒进行反选），菌落也应敏感， em>cdc11Δ）渲染酵母应允。
注意：URA3标记的覆盖载体不能包括任何天然的3'UTR，否则删除盒可以删除质粒载体而不是内源基因。
为了清楚/简单，我们将参考我们关于 CDC11 必需基因，SHS1 非必需基因和Cas9本身的概念证明。具有侧翼UTR（> 300bp）（图2）的[u1] - CDC11 - [u1]（必需基因）PCR片段应转化到cdc11Δ酵母接下来用“Dpn”进行治疗。由于在整合片段上不存在可选择的标记，应将酵母铺在含有5-FOA的培养基上（选择用于恢复CDC11基因座和细胞活力）。所有产生的酵母菌株均应通过诊断PCR和DNA测序进行验证
其次，应使用[u1] - shs1Δ:: Hyg R - [ u1]以标准方式通过用扩增的PCR产物转化酵母（来自步骤C4），并在含有潮霉素的培养基上进行选择（图2）。 >
第三，应该通过添加一个（或两个）版本的Cas9-表达盒 - 侧翼为[u1]或[u2]位点来修改HIS3 基因座。由于包含“HIS3”和“3'UTR”序列（500bp）的整个Cas9盒（图3）的大尺寸，可以使用Cas9基因内部的引物产生两个扩增的PCR产物（产生用于重组的至少100bp的内部重叠），用DpnI处理，共转化到酵母中（来自步骤C5），并在含有G418的培养基上选择。殖民地也应该测试潮霉素抗性;由于所有基于MX的药物盒之间的共同启动子和终止子序列（Goldstein和McCusker，1999），建议每轮选择后确认所有标记的基因座（通过生长表型并可能通过诊断性PCR），因为存在标记“交换”的倾向，可能与所需站点的集成竞争。 Cas9表达盒的整合载体可以靶向任何一种。具有大约5'和3'UTR序列（在HIS3基因的任一侧的1,000bp内）的酿酒酵母菌株。这种整合在含有完整的HIS3 基因his3Δ1或his3Δ0酵母的菌株中也是有效的。
注意：确认最终的[u1]和[u2]侧翼菌株应包括使用高保真聚合酶，PCR纯化和DNA测序的三个操纵基因座（CDC11，SHS1和HIS3）的PCR扩增

CRISPR / Cas9复合编辑在芽殖酵母中使用人造目标位点

修改的酵母转化方案用于Cas9编辑。首先，为含有所有六个[u1]位点的酵母菌株以及URA3标记的酵母菌株制备过夜培养物（合成辍学培养基减去尿嘧啶，2％棉子糖，0.2％蔗糖，参见食谱）覆盖表达WT CDC11的载体，并在30℃温育
酵母菌株应该被稀释到大约0.30的OD 600中，进入YPGal（2％半乳糖）中，并在30℃下再培养4.5小时以诱导Cas9表达。
应以7,300 xgg收获大约10 OD 600细胞，用0.5ml水洗涤，以相同的速度再次离心一次，并用无菌的方法除去水移液器。
应将酵母重悬于0.5ml 100mM无菌乙酸锂中，以7300×g离心，然后除去上清液（将细胞留在管中）。
应创建一个'PEG主混合物'（新鲜），包含以下物质：240μl50％聚乙二醇（PEG），36μl1M乙酸锂，50μlSS DNA（煮沸10分钟并在冰上冷却）和可变量的无菌水（供体DNA，质粒DNA和水应该总共34μl）。混合物（包括水）应分开涡旋，并加入酵母颗粒中
Cas9编辑的DNA应包括以下内容：
1. sgRNA质粒（总数在1000-1,500ng之间）
2. 供体DNA（每个编辑的基因座）作为扩增的PCR片段（1,000-1,500ng总DNA，基于PCR产物的长度而变化）。
Cas9编辑的对照反应应包括（i）空载不含sgRNA的pRS425载体，即使在不存在任何供体DNA的情况下也可用作转化体总数的上限; （ii）在YPDex（2％葡萄糖）（见食谱）中培养的酵母（参见食谱）而不是半乳糖 - 然而，鉴于代谢活性和总细胞数的差异，这可能产生显着不同数量的转化菌落，和/或（iii）包含的sgRNA质粒，并且没有任何种类的供体DNA（无菌水） - 这导致Cas9诱导的双链断裂，但是需要任何存活的酵母在每个DSB位置进行NHEJ（两个对照在图5中示出）。

图5.来自基于Cas9的编辑体内实例结果。 A.生成的酵母菌株与三个位点侧翼的六个相同的[u1]人造遗址示意图（GeneX，GeneY ，和Cas9位于HIS3基因座），并且在为每个基因座加入[u1]和供体DNA的sgRNA之后，为所有编辑的基因组位置预期的替换等位基因（WT）。 B.作为概念证明，我们提供了Cas9 mCAL编辑体内的示例数据。板A包括用sgRNA转化的酵母和所有三个供体PCR片段。板B包括sgRNA但没有供体DNA。板C包括空质粒（与引导RNA质粒骨架相同）且不含供体DNA。因为DSB在酵母中是致命的，所以板B导致没有可行的菌落，而供体DNA的包含允许修复每个操纵位点和大量的菌落。所提供的实施例不使用用于整合的供体DNA的任何选择，并且仅选择覆盖载体（URA3）和单个sgRNA质粒（LEU2）的存在。 />
在将PEG母液混合物加入酵母后，应加入适量的DNA（质粒和PCR），并将管子最大旋转10秒以达到完全再悬浮。
应在42℃热休克45分钟，以7300×g离心1分钟，用移液管除去PEG混合物。
应将酵母重新悬浮于新鲜的YPGal液体中，并置于30℃过夜（14-16小时）以回收。
恢复后，细胞（和YPGal液体）应直接镀在SD-URA-LEU板上，并在30℃下孵育3天，然后成像。我们的概念证明的三个示例条件如图5所示。板A.酵母用sgRNA [u1]质粒和供体DNA转化所有三个基因座。酵母B.用sgRNA [u1]质粒转化酵母，无供体DNA。用空的pRS425载体转化酵母酵母并没有供体DNA。每个板上记录菌落总数（图5底部）。 Cas9诱导的DSB使细胞不可行（图5B），但是对于所有三个基因座包含供体DNA允许通过同源重组进行后续修复，并拯救细胞活力（图5A）。
注意：概念证明说明了Cas9编辑与人工位点的使用，没有标记选择（缺乏选择覆盖载体的尿嘧啶，而缺乏亮氨酸选择[u1] sgRNA的存在）。但是，如果需要，可以使用选择/标记。

编辑基因组序列的验证

酵母菌Cas9编码的确认应首先从克隆分离株中制备基因组DNA（Amberg等人，2006）。
应使用基因组DNA作为模板进行诊断性PCR，以测试被操纵基因座的身份和大小（在我们的例子中，CDC11，SHS1和/ HIS3 ）来评估供体DNA是否适当地整合到基因组中。作为实例，当在2％琼脂糖DNA凝胶上分离时，除去CDC11的侧翼[u1]位点（和用天然基因替换）在人造部位损失时显示出小的变化。类似地，WT SHM1基因的整合（代替缺失）允许PCR组合提供正确整合的证据。
最后，操纵基因座应该再次扩增，纯化，并进行DNA测序。
注意：如图所示，示例策略说明了侧翼为[u1]位点的Cas9表达盒。我们还通过构建[u2]侧翼Cas9盒带以及适当的引导RNA和供体DNA（Finnigan和Thorner，2016），编辑其他位点后，对Cas9进行了顺序的消除。在这种情况下，连续的转化将允许以后的时间去除Cas9基因。

数据分析

对于质粒和酵母菌株构建的所有阶段（程序A-E），进行诊断PCR和通过DNA测序的最终确认，以评估所有组装的DNA片段（质粒或基因组）是否按预期生成。使用在线DNA校准程序（生物工作台，圣地亚哥超级计算机中心）分析桑格序列。对于图5，使用扇区法计数菌落;独立实验一式三份进行，仅提供每个试验的代表性平板（ http://www.g3journal.org/content/6/7/2147.long ）（Finnigan and Thorner，2016）。

笔记

我们的系统包含了一些重要的改进和新颖的用途，用于在芽殖酵母中进行基于CRISPR / Cas9的基因编辑。

使用单个sgRNA靶向多个基因座位点（减少对多个sgRNA构建体的需求）
构建复合体或途径的所有基因侧翼的所有独特位点预编程的初始酵母菌株将允许通过Cas9进行大规模并行的未来复制和菌株生成;所有的组合都是可能的，因为每个未修饰基因的WT拷贝可以很容易地被修复（如我们已经显示的）
允许无缝切除Cas9基因本身与修改其他基因座或在未来时间顺序。
任何一侧（侧翼）人造遗址编程的目的地确保整个基因/标记/盒的切除，并有助于防止混杂交叉，如果单个等位基因或类似突变体需要整合到WT拷贝的位置。
这个过程可以用来编辑基因的基因
该方法可用于全部染色体片段，基因组或多个基因的缺失或修饰
基于Cas9的编辑可以实现无标记整合（携带引导RNA的质粒在无选择压力的情况下容易丢失）。
减少/消除离靶效应 - 由于绝对控制将在基因组内靶向的序列，因此应有助于优化编辑，同时将Cas9的募集减少到相似或其他基因组位点。
由于在基因组内多次具有完全相同的独特人造部位，因此可以全面筛选/搜索可能改变Cas9编辑的局部表观遗传或位置效应，因为sgRNA和靶序列在基因组上是相同的。
合成基因组工程中的援助 - 包含Cas9靶位点将允许整个基因组的未来编辑，染色体分裂，重排，等等。

食谱

YPD液体介质
1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％葡萄糖
高压灭菌
YPGal
1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％半乳糖
YP高压灭菌，半乳糖过滤器灭菌，混合
SOC媒体
2％胰蛋白胨
0.5％酵母提取物
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
1mM MgCl 2
1mM MgSO 4
20 mM葡萄糖终浓度
YPD板（如果需要，包括适当的药物）
1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％葡萄糖
20克/升Bacto琼脂
高压灭菌
媒体冷却后， 55°C
合成辍学媒体（例如，，-URA-LEU）
1.7克酵母氮碱减去硫酸铵和负氨基酸
5.0g硫酸铵
1.1g“几乎完全”的氨基酸混合物
剩余氨基酸混合物（全部来自Sigma-Aldrich，甲硫氨酸150mg / L;赖氨酸180mg / L;组氨酸60mg / L
注意：如果需要，亮氨酸260 mg / L和尿嘧啶20 mg / L。
10毫克/升色氨酸（过滤灭菌，不经高压灭菌）
2％葡萄糖
20克/升Bacto琼脂
将无菌水和琼脂与剩余组分分开混合并高压灭菌
5-FOA板
合成培养基成分（适当的氨基酸辍学，如有）
0.5 g / L 5-FOA
0.5 g / L尿嘧啶
将所有组分（与水/琼脂混合物分开）加热至75℃30分钟，过滤灭菌并与高压消毒的水/琼脂混合物结合使用
LB板（含适当药物）
1％胰蛋白胨
0.5％酵母提取物
15 g / L琼脂
10g / L NaCl
4 mM NaOH
TAE缓冲液（1x终浓度），pH8.4。
40mM Tris（1M储备溶液）
20mM冰醋酸
1mM EDTA（0.5M储备溶液，pH 8.0）

致谢

该项目由国家卫生研究院国家综合医学研究所的机构发展奖（IDeA）得到支持，授权号为P20 GM103418，提交给G.C.F.内容完全是作者的责任，并不一定代表国家综合医学科学研究所或国家卫生研究院的官方观点。这项工作得到堪萨斯州立大学约翰逊癌症研究中心创新研究奖（G.C.F.）的支持。这项工作得到堪萨斯州立大学艺术和科学学院的本科研究奖（R.M.G.）的支持。该协议由（Finnigan和Thorner，2016）修改和修改。我们要感谢Jeremy Thorner（加利福尼亚大学伯克利分校）提供有用的建议和意见。