材料和试剂

培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：351029）
15 ml Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352096）
细胞过滤器（Corning，Falcon ®，目录号：352340）
5 ml无菌移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357543）
10 ml无菌移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357551）
200μl无菌提示（Biotix，Neptune ®，目录号：2102 NS）
1000μl无菌提示（Biotix，Neptune ®，目录号：2372 S）
24孔板（Corning，Falcon ®，目录号：353047）
50ml Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
10ml注射器（Terumo Medical，目录号：SS + 10S21381）
1 ml注射器，26 G½针（Terumo Medical，目录号：SS + 01H26131）
2 ml注射器柱塞（Terumo Medical，目录号：SS-02S2238）
6孔板（Corning，Falcon ®，目录号：353046）
具有0.4μm半透明高密度PET膜的24孔板的透气性支撑（Corning，Falcon ®，目录号：353495）
LS列（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
MS色谱柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
巴斯德吸管（Sigma-Aldrich，目录号：Z627992-1000EA）
6周龄的C57BL / 6雌性小鼠（C57BL / 6NCr1）（Charles River Laboratories，目录号：027）
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875093）
FCS（Thermo Fisher Scientific，目录号：A3160801）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030024）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630056）
2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31350010）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15250061）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：10010023）
牛血清白蛋白（BSA）（Rockland Immunochemicals，目录号：BSA-50）
乙二胺四乙酸（EDTA）（AppliChem，目录号：131669.1211）
CD11b MicroBeads，人和小鼠（Miltenyi Biotec，目录号：130-049-601）
CD11c MicroBeads UltraPure，Mouse（Miltenyi Biotec，目录号：130-108-338）
HBSS，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14170088）
氯化钠（NaCl）（CARLO ERBA试剂，目录号：479687）
Tris（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610719）
氯化钾（KCl）（CARLO ERBA试剂，目录号：471177）
重组鼠GMCSF（PeproTech，目录号：315-03）
重组鼠IL-4（PeproTech，目录号：214-14）
来自<溶解性Clostridium histolyticum 的胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C5138-1G）
Histodenz（Sigma-Aldrich，目录号：D2158-100G）
Nor-NOHA（Cayman Chemicals，目录号：10006861）
MACS缓冲区（请参阅配方）
RPMI培养基（参见食谱）
TCCM（见配方）
胶原酶100 U / ml和400 U / ml（见配方）
Nycodenz（见食谱）
Nycodenz缓冲液（参见食谱）

设备

剪刀（IsolabLaborgeräte，目录号：048.25.130）
无菌生物安全柜
P20L移液器（Pipetman L）（Gilson，目录号：FA10003M）
P200L移液器（Pipetman L）（Gilson，目录号：FA10005M）
P1000L移液器（Pipetman L）（Gilson，目录号：FA10006M）
吸管控制器（Corning，Falcon ®，目录号：357471）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：BB15）
-80°C冷冻（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM 88000系列）
光学显微镜（ZEISS Primostar）
MiniMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
MidiMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）

程序

MDSC与骨髓分离

取两只C57BL / 6小鼠的后肢切开骨头。
在无菌生物安全柜下，彻底清除骨骼中的肉体。将骨头放入陪替氏培养皿中，并使用10 ml注射器（26 G½针）在每只大腿骨内注射10 ml的完整RPMI培养基（见食谱），以提取骨髓。
吸出并排出培养基，直到骨髓细胞完全重新悬浮，使用相同的初始10ml RPMI。
将骨髓细胞悬浮液转移到配备40μm细胞过滤器的15 ml Falcon管中，然后取出细胞过滤器并离心（582 x 10 g，10 min，RT）。
弃去上清液，将细胞重新悬浮在10ml新鲜的完整RPMI中
计数细胞，以台盼蓝（从4条腿，约50×10 6 细胞）适当地稀释它们。
离心细胞悬浮液（582 x g，10分钟，RT）
排序CD11b + 单元格：
1. 将细胞沉淀物重悬于80μl冰冷的MACS缓冲液（参见Recipes）/10μg/ ml总细胞中。
2. 每10个总细胞中加入20μlCD11b微珠。
3. 混匀，4℃孵育15分钟
4. 通过每10个细胞加入1-2ml冰冷的MACS缓冲液洗涤细胞并离心（582 x g，10分钟，4℃）。
5. 在500μlMACS缓冲液中重悬10个细胞。继续进行磁选。
6. 将柱置于磁场中，并用适量的缓冲液冲洗：MS柱500μl（最多10μL），LS柱3 ml（10“细胞至10 9细胞）
7. 将细胞悬液涂于柱上。收集未标记的细胞，通过并用适量的缓冲液洗涤柱。通过加入冰冷的MACS缓冲液进行洗涤步骤三次，每次一次柱储存器空（MS柱：3×500μl，LS柱：3×3ml）。收集总流出物（未标记的细胞分数）。
8. 从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。
9. 移取适量的缓冲液到柱上。用柱子提供的柱塞（MS：1 ml，LS：5 ml）立即用磁性标记的细胞冲洗成分。
10. 将标记的细胞（CD11b + 细胞）离心（582×g，10分钟，RT）。通常，从50×10 6个细胞中，CD11b +细胞的回收率约为15×10 6个细胞。
在含有30％TCCM（参见食谱），20ng / ml GMCSF和20ng的完整RPMI中重新分选CD11b + 细胞（1×10 6细胞/ ml） / ml的IL-4。将GMCSF和IL-4重新悬浮于RPMI中并等分并储存于-80℃。
将细胞在24孔板中平皿1ml /孔。在37℃孵育细胞4天。
4天后更换培养基：通过将其移液到50ml Falcon管中回收细胞并离心（805×10 5分钟，RT）。弃上清，加入含有30％TCCM，20ng / ml GMCSF和20ng / ml IL-4的新RPMI。在24孔板中再次将细胞1ml /孔。
7天后，从脾脏分离CD11c + DC。

CD11c + 与脾脏隔离的DCs

开始之前，准备2个胶原酶溶液;对于每个脾脏，如食谱部分所述，制备1ml每种胶原酶溶液（15ml 100和15ml 400U / ml）（参见食谱）。
从15只C57BL / 6小鼠取脾。
将脾脏置于培养皿中，每只脾注射1ml 100U / ml胶原酶溶液（即，15只脾，使用15ml 100U / ml胶原酶溶液），使用10 ml注射器，26 G½针，直到脾脏变色（脾脏颜色应从红色渐变为白色）。重复此步骤。
回收细胞悬浮液，并将其过滤在配有40μm细胞过滤器的50ml Falcon管中，已经含有5ml完整的RPMI。将此上清液保持在室温。
在37℃下将脾脏用1ml / 400U / ml胶原酶溶液孵育30分钟。
在10ml注射器中回收胶原酶溶液，并使用2 ml注射器柱塞匀浆脾脏。
使用先前回收的胶原酶溶液将脾脏完全重悬，直到所有脾细胞均处于溶液状态。确保细胞均匀重悬，然后将细胞悬浮液通过细胞过滤器过滤到已经含有用100U / ml胶原酶处理的脾脏回收的第一细胞悬液的相同的50ml Falcon管上。
取出细胞过滤器并离心（582 x g，10分钟，RT）。
弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于15ml（1ml /脾）由54％Nycodenz（参见食谱）和46％Nycodenz缓冲液（参见食谱）组成的溶液中。将获得的细胞悬浮液分成三个15ml Falcon管（5ml /管）
仔细覆盖每个含有5ml细胞悬浮液的管中的3ml RPMI培养基（图1A）
离心机为1,811 x g，15分钟，4℃无刹车。
使用巴斯德吸管在两相界面处恢复环，并将细胞转移到新的50ml Falcon管中（图1B）。

图1.通过密度梯度从脾细胞中分离树突状细胞。：一种。在离心之前，脾细胞的密度梯度重悬于Nycodenz（下相）和中等RPMI（上相）。 B.离心后脾细胞的密度梯度：界面处的环含有CD11c +树突状细胞。
加入10ml RPMI培养基，并以582 x g，10分钟RT离心。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10ml完整的RPMI中
计数细胞并再次以582 x g，10分钟RT离心。通常，一个脾脏的恢复是约100×10 6个细胞。
将细胞沉淀物重悬于8.5μl冰冷的MACS缓冲液中，每10次总共细胞。
每10个细胞总共加入1.5μlCD11c微珠
混匀，4℃孵育15分钟
通过加入1-2毫升冰冷的MACS缓冲液/ 10 7细胞洗涤细胞，并以582 x g，10分钟RT进行离心。
在500μl冰冷的MACS缓冲液中重悬10个细胞。继续进行磁选。
将柱置于磁场中，并用适量的缓冲液冲洗：MS柱500μl（最多至10个细胞），LS柱3 ml（从10μg/至10 9 单元格）。
将细胞悬液涂于柱上。丢弃未标记的细胞，通过适当量的缓冲液洗涤柱。通过加入冰冷的MACS缓冲液进行洗涤步骤三次，每次一次柱储存器空（MS柱：3×500μl，LS柱：3×3ml）。收集总流出物（未标记的细胞分数）。
从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。
移取适量的缓冲液到柱上。用柱子提供的柱塞（MS：1 ml，LS：5 ml）立即用磁性标记的细胞冲洗成分。
将标记的细胞（CD11c + 细胞）（582 x g，10分钟，RT）离心，弃去上清液，将细胞重悬于10ml完整的RPMI中并计数。通常，CD11c + 细胞的恢复是来自一个脾脏的约1×10 6个细胞。
在完全RPMI中重悬细胞（1.5×10 6细胞/ ml），并在6孔板中将4ml /孔板平板。在37℃，5％CO 2 孵育CD11c + 细胞过夜。

MDSCs和CD11c + DCs的共同培养
对于以1:2比例的MDSC和CD11c + DC的共培养物：

恢复和计数CD11c + 单元格。在700μl完整的RPMI中重悬1×10 6个细胞。板细胞在24孔板中。考虑每个共培养样品（ ie ，CD11c + 单独1×10 CD11c + ，与用Nor-NOHA处理的MDSC共培养的未处理的MDSC和CD11c +共同培养的CD11c + / sup同时抑制Arg1酶活性）。
将含有CD11c + 细胞的每个孔放入填充有100μl完整RPMI（无MDSC））的transwell，并在37℃下孵育1小时。
同时，用合适的刺激（即，有和没有150μMNor-NOHA的培养物）孵育MDSC 1×10 6细胞/ ml，以抑制Arg1酶活性） h，然后回收和离心MDSC（582 xg，10分钟，RT）。
在100μl完整的RPMI中重悬MDSC 0.5×10 6个细胞。
将100μlMDSCs悬浮液加入适当的transwell中，并在37℃下孵育过夜
恢复MDSC和CD11c + 细胞和上清液并进行所需的分析（即，，使用皮肤试验的延迟型超敏反应测定法（Mondanelli等人， em>，2017），以评估与MDSC共培养后CD11c DC的功能表型。

数据分析

通常，MDSC与DCs的共培养必须重复至少三次以获得统计学上相关的数据。使用非配对学生的测试用于体外分析，使用至少三个来自每组2-3次实验的值（Mondanelli等人，2017）。

笔记

所有步骤都应在无菌条件下进行。即使从安乐死的小鼠中分离腿部和脾脏，强烈建议使用高压消毒的解剖工具和喷雾乙醇。
所有介质应在37°C使用前加温。
通常，MDSC的纯度为约60％，CD11c 细胞的纯度为约95％。更详细地说，TCCM和细胞因子刺激后超过60％的MDSCs是CD11b和Gr1阳性细胞。 CD11c + 细胞为90-95％CD11c +， 95％MHC I-A + ，＆gt; 95％B7-2 + ，＆lt; 0.1％CD3 + ，并且看起来由90-95％的CD8 +，5-10％CD8 +，和1-5％ B220 + PDCA + （ ie ，浆细胞样DC或pDC）细胞。
如文献报道，有几种MDSCs分化方法，包括使用GCSF，GMCSF和IL-13，或GMCSF和IL-6，或通过PGE2。我们使用TCCM，GMCSF和IL-4，因为在这些特定的MDSC中，我们评估了Arg1的最高表达和功能活性。
BMDC也可用于本协议;为了使用我们用于确定Arg1表达和功能的相同的DC（Mondanelli等人，2017），我们使用脾脏DCs与MDSC共同培养。

食谱

注意：所有缓冲液和培养基应无菌。

RPMI媒体
加入RPMI 1640培养基10％FCS（Thermo Fisher Scientific）
2mM L-谷氨酰胺（储备溶液200mM）
100 U / ml青霉素 - 链霉素（储液10,000 U / ml）
10mM HEPES（储备溶液1M）
50μM2-巯基乙醇（储备溶液50mM）
MACS缓冲区（存储在4°C）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.2
0.5％牛血清白蛋白（BSA）
2 mM EDTA
TCCM
1. 为了产生肿瘤细胞条件培养基（TCMM），将亚汇合的B16黑素瘤细胞保持在具有降低（3％）血清浓度的RPMI 1640培养基中48小时
2. 之后，收集上清液，等分并保存在-80℃，直到进一步使用（Youn等人，2008）
胶原酶100U / ml和400U / ml
1. 在HBSS w / o Ca和Mg中制备8,000 U / ml胶原酶的储备溶液，并将此溶液在-20°C下等分（1 ml /管）
2. 从储备溶液开始，将HBSS中的胶原酶稀释至100 U / ml，HBSS中将400 U / ml稀释，并将其保存在4°C
Nycodenz（储存于4°C）
将30.55克组胺化至100ml Milli-Q水（最终体积）中过滤0.22μm过滤器，防止光线
Nycodenz缓冲液（等分并储存于-20℃）
9克NaCl
0.6055克Tris
0.22368克KCl
0.11167g EDTA
溶解在900毫升Milli-Q水中将pH调节至7.5
将音量调至1 L
过滤0.22μm过滤器，等分并储存

致谢

这项工作得到欧洲研究委员会（338954-DIDO; Ursula Grohmann教授和Antonio Macchiarulo）以及意大利Ricerca大学dell'Istruzione大学（FIRB RBAP11T3WB; Ursula Grohmann教授，Vincenzo Bronte教授和Silvio教授的支持） Bicciato; PRIN 2015C2PP7至Claudia Volpi）。该协议由Mondanelli等人改编而成。（2017）。

参考

Marvel，D. and Gabrilovich，DI（2015）。＆nbsp; 骨髓衍生的抑制细胞在肿瘤微环境中：预期意想不到。 J Clin Invest 125（9）：3356-3364。
Mondanelli，G.Bianchi，R.，Pallotta，MT，Orabona，C.，Albini，E.，Iacono，A.，Belladonna，ML，Vacca，C.，Fallarino，F.，Macchiarulo，A.，Ugel， S.，Bronte，V.，Gevi，F.，Zolla，L.，Verhaar，A.，Peppelenbosch，M.，Mazza，EM，Bicciato，S.，Laouar，Y.，Santambrogio，L.，Puccetti，P 。，Volpi，C.和Grohmann，U.（2017）。＆nbsp;

Ostrand-Rosenberg，S.，Sinha，P.，Beury，DW and Clements，VK（2012）。＆nbsp;

Ugel，S.，De Sanctis，F.，Mandruzzato，S.and Bronte，V.（2015）。＆nbsp; J Clin Invest 125（9）：3365 -3376。

Youn，JI，Nagaraj，S.，Collazo，M.and Gabrilovich，DI（2008）。＆nbsp; 荷瘤小鼠中骨髓来源的抑制细胞的亚群 .J Immunol 181（8）：5791-5802。