材料和试剂

注意：试剂因qPCR设备而异。在这里，我描述了使用LightCycler ® 480（Roche）进行绝对定量的协议。对于每个反应，强烈建议使用两个或多个技术重复

移液器提示：
10-μl提示（例如，Fukaekasei和Watson，目录号：110-201C）
200-μl提示（Fukaekasei和Watson，目录号：1201-705C）
1,000μl提示（Fukaekasei和Watson，目录号：110-706C）
为了降低污染的风险，请使用过滤的提示，例如，
10-μl提示（Fukaekasei和Watson，目录号：1251-204CS）
200-μl提示（Fukaekasei和Watson，目录号：1252-703CS）
1000μl提示（Fukaekasei和Watson，目录号：124-1000S）]优选
1.5ml离心管（例如，Fukaekasei和Watson，目录号：131-7155C）
50毫升例如Falcon 50毫升圆锥形离心管（Corning，Falcon，目录号：352070）]的离心管]
LightCycler ®480 Multiwell Plate 96，white（Roche Molecular Systems，目录号：04729692001，包括密封箔）
要测量的模板DNA（从昆虫提取的基因组DNA）
标准DNA（PCR产物或已知浓度的插入质粒DNA）的模板DNA
LightCycler ®480，缓冲液1（2x主混合物）（Roche Molecular Systems，目录号：04707516001）
LightCycler ®480，缓冲液2（H 2 O 2）（Roche Molecular Systems，目录号：04707516001）
正向和反向引物
反应混合（见配方）

设备

分光光度计（Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec TM 3000）
连接到计算机的LightCycler ® 480系统（Roche Molecular Systems，型号：LightCycler ® 480）
离心机用于96孔板（例如，久保田，型号：PlateSpin II）
移液器[例如，PIPETMAN P10（Gilson，目录号：F144802），P20（Gilson，目录号：F123600），P100（Gilson，目录号：F123615） P200（Gilson，目录号：F123601）或P1000（Gilson，目录号：F123602）]
层流柜

软件

LightCycler ® 480软件版本1.5.1（Roche Molecular Systems）
Primer3Plus免费在线软件（ http://primer3plus.com/ ）

程序

设计底稿
使用目标细菌的单拷贝基因进行引物设计（避免使用核糖体基因，因为可能存在操纵子拷贝）。例如，细菌基因RpoB （Case 等人，2007）被认为是合适的。如果需要，设计用于宿主（昆虫）基因的引物来标准化细菌滴度。使用来自自体免疫球蛋白的单拷贝核基因（不推荐线粒体基因）通常使用长度为18-23的引物。产品尺寸应为80-300bp（最佳值：80-150bp）。所需的熔融温度（T m）为55-65℃，两个引物的T m中的最大差值为3℃。强烈建议您使用一个软件，如Primer3Plus免费在线软件（ http://primer3plus.com/ ），设计引物已经成功用于检测昆虫内共生体的一些引物在表1中给出。

表1.已成功用于qPCR的内共生菌的引物实例
准备DNA模板
从全身或特定的昆虫组织/器官中提取DNA。通常每次反应需要50-100ng的DNA。使用纯化的DNA，例如使用酚氯仿法提取的DNA（Green和Sambrook，2012）或商业试剂盒，例如DNeasy＆amp; Blood＆amp;推荐使用组织试剂盒（QIAGEN）。提取的DNA的浓度可以使用分光光度计测量。确认A 260> / 280 是大约1.8，而＆lt; 260＆gt; /＆lt; 230＆gt;是＆gt; 1.如果可能，也应该使用从抗生素处理的昆虫中提取的DNA作为对照，因为这将表明扩增的DNA是否源于细菌或宿主基因组（详见附注1）。
准备标准DNA
为了绝对定量，需要具有已知拷贝目标基因的DNA样品。 DNA样品可以是PCR产物或插入的质粒。拷贝数可以通过使用分光光度计测量的质量浓度来估计，其具有Avogadro常数N A = 6.022×10 23 /拷贝/ mol，假设分子量为1b dsDNA约为660g / mol。使用标准DNA的连续稀释液，例如10'，10"，10"，10"，10"，5" 10 4 和10 3 副本。
准备反应混合物（参见食谱），旋转5秒，并向每个孔中分配20μl 应用5μlDNA模板（样品或标准DNA）或缓冲液2（阴性对照）（图1）

图1.样品片的实施例 ST：具有已知浓度的标准DNA，NTC：非模板对照（H 2 O 2）。当进行两次重复时，可以测量41个样品。
用密封箔密封多孔板，并以900×g离心30秒。
典型的PCR程序可能如下：
1. 95℃初始变性30秒
2. 95℃变性5秒。
3. 在X°C退火10-30秒（X取决于T ）。
4. 延长10-20秒（取决于产品长度，1分钟kb -1 ）在72°C。
5. 返回步骤（b）40个循环。
6. 在60°C-95°C熔化。
如果两个引物的T sub相当高（> 65℃），则可以如下使用两步PCR：
1. 95℃初始变性30秒
2. 95℃变性5秒。
3. X°C退火延伸10-30 s（X取决于T ）
4. 返回步骤（b）40个循环。
5. 在60°C-95°C熔化。
注意：
1. 数据采集应在每个循环的延伸步骤（生成扩增曲线所必需的条件）下进行，并在最终熔化下连续进行（生成熔解曲线所必需的;图2）。
2. 在制备混合物时，应特别注意避免污染。建议在干净的环境中使用特殊的移液器，例如在层流柜中。
3. 如果不需要对细菌进行分类，则可以选择保守的细菌基因。如果重点在于特定的家族，属或物种，则应该相应地选择靶基因。应该避免在基因组中具有多个拷贝的基因，如许多外膜蛋白基因。值得注意的是，应避免应变特异性和含SNP的基因，因为它可能危及实验。
4. 在设计引物时，引物对靶基因的特异性很重要。可能存在类似非目标序列的BLAST搜索将有助于选择特异性引物。也希望产品大致相同的大小。

数据分析

每次反应后，检查解链曲线以确认正确的产品已被放大。循环阈值（Ct）值为> 35应视为未感染或感染不明显的水平。

图2.熔化曲线熔化曲线应均匀（左面板上的红线）。两个或更多个图案（例如右图所示的红色和绿色线）表示PCR产物不同。

笔记

对于任何细菌内分泌物的检测，由于可能的伪阳性（尽管大多数可以使用解链曲线确定）或由于水平基因转移（HGT）产生的片段的扩增，仅依赖于PCR和qPCR是有风险的。已知许多昆虫物种在其染色体中携带各种大小的细菌基因组片段（Dunning Hotopp et al。，2007）。因此，期望使用多个靶基因降低从昆虫基因组靶向HGT基因的可能性。如果可能，在使用qPCR检查细菌滴度之前或之后，使用FISH观察目标细菌。还可以测试用抗生素治疗的昆虫（四环素盐酸盐对几乎所有细菌物种都有效），以证明这是否消除/减少了内分泌物种群。
为了标准化细菌滴度，最好使用总基因组DNA的质量浓度作为分母。然而，这可能导致细菌密度的不精确估计，因为细菌DNA对总基因组DNA的贡献可能是显着的。例如，与其他专性内分泌物相比，其密度相对较低的Wolbachia pipientis （基因组大小： 1.2Mb）通常产生约10-50倍的拷贝数如昆虫核DNA（Goto等人，2006））。由于昆虫基因组大小一般为100-300Mb，细菌DNA可能占总基因组DNA的多达3.3％-50％，这个比例太大，不能忽视。
对于细菌滴度的标准化，不推荐线粒体序列拷贝，因为线粒体的密度可以根据环境，宿主生理学和抗生素的使用而改变。值得注意的是，四环素处理在果蝇模拟物中治疗后二代影响线粒体代谢和mtDNA密度（Ballard和Melvin，2007）。

食谱

反应混合物
在每个孔（25μl反应）中，加入以下试剂：
缓冲液1（2x缓冲液），12.5μl
缓冲液2（H 2 O 2），2.5μl
引物A（10μM），2.5μl
引物B（10μM），2.5μl
通常，对于一个板（96孔），可以通过以下容积加入试剂在50ml管中制备预混物：
缓冲液1（2x缓冲液），1,250μl
缓冲液2（H 2 O 2），250μl
引物A（10μM），250μl
引物B（10μM），250μl

致谢

这项工作得到日本的KAKENHI（16K08106）的支持。

参考

Ballard，J.W.and Melvin，R.G。（2007）。四环素治疗影响治疗后二代的线粒体代谢和mtDNA密度a href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18093008"target ="_ blank">果蝇。 Insect Mol Biol 16（6）：799-802。
Baumann，P.，Baumann，L.，Lai，C.Y.，Rouhbakhsh，D.，Moran，N.A。和Clark，M.A。（1995）。 Buchnera属的遗传学，生理学和进化关系：细胞内共生体的蚜虫。 Annu Rev Microbiol 49：55-94。
Case，R.J.，Boucher，Y.，Dahllöf，I.，Holmström，C.，Doolittle，W.F。和Kjelleberg，S。（2007）。使用16S rRNA和rpoB基因作为微生物生态学研究的分子标记物。应用环境微生物73：278-288。
Caspi-Fluger，A.，Inbar，M.，Mozes-Daube，N.，Mouton，L.，Hunter，M.S。和Zchori-Fein，E。（2011）。 '''和'out'：两种不同的定位模式同一昆虫物种中的细菌共生体。 PLoS One 6（6）：e21096。
Dunning Hotopp，JC，Clark，ME，Oliveira，DC，Foster，JM，Fischer，P.，Munoz Torres，MC，Giebel，JD，Kumar，N.，Ishmael，N.，Wang，S.，Ingram，，Nene，RV，Shepard，J.，Tomkins，J.，Richards，S.，Spiro，DJ，Ghedin，E.，Slatko，BE，Tettelin，H.and Werren，JH（2007）。从细胞内细菌到多细胞真核生物的广泛的侧向基因转移。科学 317（5845）：1753-1756。
Goto，S.，Anbutsu，H。和Fukatsu，T。（2006）。 Wolbachia 和 Spiroplasma 内吞中的不对称互动共存于相同的昆虫宿主中。 Appl Environ Microbiol 72（7）：4805-4810。
Green，M.R。和Sambrook，J.（2012）。分子克隆：实验室手册，第四版（3卷集）冷泉港实验室 pp：1890.
Hayashi，M.，Watanabe，M.，Yukuhiro，F.，Nomura，M。和Kageyama，D。（2016）。男性的噩梦？一个母亲传播的男性杀伤细菌和一个绿色的辫子人群中的强烈的女性偏见。 PLoS One 11：e0155794。
Hedges，L.M.，Brownlie，J.C.，O'Neill，S.L。和Johnson，K.N。（2008）。 Wolbachia 和昆虫中的病毒防护科学 322（5902）：702.
Kageyama，D.，Anbutsu，H.，Watada，M.，Hosokawa，T.，Shimada，M。和Fukatsu，T。（2006）。爱因斯坦果蝇自然种群中非雄性杀死性螺旋体的患病率。 Appl Environ Microbiol 72：6667-6673。
Kageyama，D.，Narita，S.and Watanabe，M。（2012）。由他们的内在信息操纵的昆虫性别决定：发生，机制和影响。昆虫 3（1）：161-199。
Koga，R.，Tsuchida，T。和Fukatsu，T。（2009）。猝灭昆虫组织的自发荧光，用于原位检测内共生菌。 Appl Entomol Zool < / em> 44（2）：281-291。
Narita，S.，Nomura，M。和Kageyama，D。（2007）。蝴蝶中的自然发生的单次和双重感染Wolbachia 菌株> Eurema hecabe ：每种Wolbachia菌株的传播效率和种群密度动态。 FEMS Microbiol Ecol 61：235-245。
Oliver，K.M.，Russell，J.A.，Moran，N.A。和Hunter，M.S。（2003）。 ap ap ap ad ad ad ad ad ad ad ad Sci USA 100：1803-1807。
Simoncini，L.，Casiraghi，M.，Bazzocchi，C.，Sacchi，L.，Bandi，C.and Genchi，C。（2001）。用于定量细菌内分泌素（Wolbachia）的实时PCR丝状线虫。 Parassitologia 43（4）：173-178。
Watanabe，M.，Yukuhiro，F.，Maeda，T.，Miura，K.and Kageyama，D。（2014）。在的花虫中发现的Spiroplasma Orius （半翅目：Anthocoridae）：通过流体传播，与Wolbachia共存和不同的人口密度。 Microb Ecol 67：219-228。
Werren，J.H.，Baldo，L。和Clark，M.E。（2008）。 Wolbachia ：无脊椎动物生物学的主要操纵者。 Nat Rev Microbiol 6：741-751。