材料和试剂

萃取
1. 磷酸钾缓冲液65mM（pH7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
2. 对于在M9葡萄糖基本培养基中生长的大肠杆菌细胞，培养的细胞（约10 10个细胞）（例如），1ml OD _{600对应于约6×10 8个细胞）}
酶活性
1. 100mM Tris-HCl缓冲液（pH7.8）（Sigma-Aldrich，目录号：T1502）
2. 20mM ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A3377）
3. 2mM辅酶A三锂盐（CoASH）（Sigma-Aldrich，目录号：C3019）
4. 60mMβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（NAD +）（Sigma-Aldrich，目录号：N7004）
5. 50mM MgCl 2（Panreac Applichem，目录号：131396）
6. 50mM L-苹果酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：02288）
7. 1M的乙酸钠三水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S8625）
8. 来自牛心脏的50U/ml苹果酸脱氢酶（Mdh）（Sigma-Aldrich，目录号：M9004）
9. 来自猪心脏（Cs）的25U/ml柠檬酸合酶（Sigma-Aldrich，目录号：C3260）
  在milliQ水和组分5-7中在Tris-HCl缓冲液（100mM，pH 7.8）中制备试剂2-4。预先制备所有浓缩储备物（1-7），并储存在-20℃。将酶（8-9）储存在4-6℃（按照制造商的说明书），并在即将使用前在Tris-HCl缓冲液（100mM，pH7.8）中稀释。
10. 96孔平底，未处理的，未灭菌的透明平板
11. 冰冷的磷酸盐缓冲液

设备

制冷台式离心机（Eppendorf，目录号：5801R）
装备有3mm直径探针的超声匀浆器（Sonics& Materials Inc.，Vibra Cell VC 375）
分光光度计读板器（Bio-Tek）
Novaspec Plus分光光度计（Amersham Bioscience GE Healthcare Europe GmbH）
- 无菌透明板
-ice bath

程序

蛋白提取程序
1. 在感兴趣的培养阶段收获细胞，例如用于大肠杆菌，50ml指数生长期的培养物（OD <600> = 0.8）或20ml稳定期培养物（OD <600 = 2.0）。
2. 冷却细胞在水 - 冰浴1-2分钟。
3. 将细胞离心15分钟（10,000×g，4℃）。
4. 弃去上清液。
5. 将细胞重悬在冰冷的磷酸盐缓冲液中（为了确保正确清洗细胞，使用相同的初始体积的样品）。
6. 离心细胞15分钟（10,000×g，4℃）。弃去上清液。
  将细胞重悬在冰冷的磷酸盐缓冲液中。使用适当体积的缓冲液，根据以下公式计算：这将导致OD 600的50：
  的浓缩细胞悬浮液 ml（磷酸盐缓冲液）=（OD 600 = 50vol（ml培养物体积））/50
  其中OD <600>被认为是样品中细胞浓度的读出（Castano-Cerezo et al。，2011）。
7. 使用超声波均化器如下破坏细胞。转移细胞悬浮液到1.5毫升锥形管，并将其放在冰桶。使细胞悬浮液3个超声波脉冲（每个20秒，21％振幅，3毫米直径探头，50％功率输入）。在声波处理周期之间相隔60秒的间隔，以避免样品过热
8. 将破碎的细胞离心30分钟（20,000×g <4℃，4℃）。
9. 收集上清液（无细胞提取物），并将其转移到干净的1.5毫升锥形管。检查无细胞提取物的悬浮颗粒。如果需要，再次离心
10. 立即使用无细胞提取物乙酰辅酶A合成酶测定或存储上清液在-70°C长期使用。
乙酰辅酶A合成酶测定
为了适当地测定酶活性，必须为每个样品确定蛋白质提取物的最佳稀释度，因为提取的酶的活性受细胞的生理状态和提取产率的影响。
1. 在冰上解冻蛋白质提取物和试剂储备液。如材料和方法部分中所述稀释Mdh和Cs酶储备液，并将其保存在冰上。
2. 连接读板器，使其达到37°C。
3. 根据要分析的样品数量制备"主混合物"。 "主混合物"应包含除了乙酸钠（Acs的底物）和蛋白质提取物之外的所有反应组分。记住考虑样品三次。保持"主混合"在冰上。
  "主混合"每个反应：
  100mM Tris-HCl缓冲液（pH7.8）：70μl
  50mM L-苹果酸盐：10μl
  20mM ATP：10μl
  50mM MgCl 2：10μl
  2mM CoASH：10μl
  60mM NAD +：10μl
  50U/ml Mdh：10μl
  25U/ml Cs：10μl
4. 准备几个稀释的蛋白质提取物在磷酸盐缓冲液。在足够宽的范围内选择稀释度（例如：1：1，1:10，1：100和1：1,000）。
5. 在96孔平底，透明板中，向每个孔中加入140μl的主混合物。
6. 加入40μl每种蛋白质稀释液。上下移动以正确混合反应组分。提示：避免形成气泡。
7. 通过向样品中加入20ul 1M乙酸钠开始反应，并通过上下吹吸混匀
8. 在平板读数器中在37℃下孵育，并记录在340nm处的吸光度的持续增加（由于NAD 的减少）5-10分钟。开始反应后应立即开始记录。调整读数器以获得每10-20秒的吸光度值。
9. 计算每个蛋白质提取物稀释的OD随时间的最大斜率（ΔOD/min）。对于随后的测量，选择提取物的2-3个稀释度以产生ΔOD/min = 10-200。如果必要，测定其它稀释度（蛋白质浓度为约15mg/ml的大肠杆菌提取物的葡萄糖限制性固定相培养物的细胞提取物中Acs活性的典型最佳稀释度为1： 20）。
10. 重复步骤4-10，选择稀释液。执行测定，至少，一式三份。为了确保提取物中酶活性的适当测定，ΔOD/min应与蛋白质含量成比例
11. 计算使用下列方程测定的蛋白质提取物的酶活性单位：
  Acs活性（U/ml）=（ΔOD（/min）* Vr * Df）/（ε* l * Ve）其中：
  ΔOD（/min）= OD相对于t图的最大斜率（/min）
  Vr =反应体积（μl）
  Df =稀释因子
  ε NADH 340nm = 6.22ml * /μmol*/cm l =光程长度（cm）^a
  Ve =蛋白提取物体积（μl）^b
  ^a要确定光程长度，请参考96孔板的规格以获取孔的直径。从测定中使用的总液体体积和孔的直径计算光程长度。
  ^b此体积是指添加到测定中的稀释提取物的体积。
12. 测定所测定的提取物的蛋白质浓度[例如。使用Lowry（Hartree，1972）或二辛可宁酸方法（Smith等人，1985）。
13. 使用以下公式确定每个提取物的特异性Acs活性：
  Acs比活性（U/mg）= Acs活性（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）

食谱

所有试剂，除了Mdh和Cs稀释，可以提前准备，并在-20℃下储存长达1年。
所有试剂在100mM Tris-HCl缓冲液（pH7.8）中制备，除了应当溶解于MilliQ水中的NAD +，CoASH和ATP。
磷酸钾缓冲液（65mM）。用1M KOH调节pH至7.5。
Tris-HCl缓冲液100mM。用1M KOH调节pH至7.8

致谢

该方案首先在Brown等人（1977）中描述并改编自Brown et al。（1977），并且之前在Castano-Cerezo等人（2009）和Castano-Cerezo et al。（2011）。

参考文献

Brown，T.D.，Jones-Mortimer，M.C.and Kornberg，H.L。（1977）。大肠杆菌中乙酸盐和乙酰辅酶A的酶相互转化。 J Gen Microbiol 102（2）：327-336。
Castano-Cerezo，S.，Bernal，V.，Blanco-Catala，J.，Iborra，J.L.and Canovas，M.（2011）。 cAMP-CRP协调蛋白质乙酰化途径与中枢代谢在大肠杆菌中的表达大肠杆菌。 Mol Microbiol 82（5）：1110-1128。
Castano-Cerezo，S.，Pastor，J.M.，Renilla，S.，Bernal，V.，Iborra，J.L.and Canovas，M。（2009）。深入了解磷酸转乙酰酶（pta）和乙酸/乙酰辅酶A结构在 Escherichia coli 。 Microb Cell Fact 8：54。
Hartree，E.F。（1972）。蛋白质的测定：对提供线性光度反应的Lowry方法的修改。 Anal Biochem 48（2）：422-427
Renilla，S.，Bernal，V.，Fuhrer，T.，Castano-Cerezo，S。，Pastor，J.M.，Iborra，J.L.，Sauer，U.and Canovas，M.（2012）。大肠杆菌中的乙酸清除活性：乙酰辅酶A合成酶和在chemostat培养物中的PEP-乙醛酸循环。 Appl Microbiol Biotechnol 93（5）：2109-2124。
Smith，PK，Krohn，RI，Hermanson，GT，Mallia，AK，Gartner，FH，Provenzano，MD，Fujimoto，EK，Goeke，NM，Olson，BJand Klenk，DC（1985） //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3843705" target ="_ blank">使用二喹啉酸测量蛋白质。 Anal Biochem 150（1）：76-85。