材料和试剂

扫描电子显微镜（SEM）和运动精子细胞结构

移液器提示1-200μl（Carolina Biological Supply，目录号：215055）
巴斯德移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-4）
制造商：Corning，目录号：C7095B5X。
1.5 ml离心管（USA Scientific，目录号：1615-5500）
玻璃盖玻片22 x 22毫米（费雪科学，目录号：12-542B）
具有成熟精子细胞的雄性植物
1. > la>>>>。。。。。。。。
2. Conocephalum conicum
4. Ceratopteris richardii
Sorensens磷酸盐缓冲液，0.2M，pH7.2（Electron Microscopy Sciences，目录号：11600-10）
戊二醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：16120）
二甲胂酸钠缓冲液，0.2M，pH 7.4（电子显微镜科学，目录号：11652）
四氧化锇（Electron Microscopy Sciences，目录号：19150）
乙醇（Decan Laboratories，目录号：2705HC）
六甲基二硅氮烷（HMDS）（Electron Microscopy Sciences，目录号：16700）
0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见配方）
0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（见配方）
0.02 M磷酸缓冲液（pH 7.2）（见配方）
2.5％戊二醛（见食谱）
0.05 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）（见配方）
2％四氧化锇水溶液（见配方）

设备

扫描电子显微镜（SEM）（FEI，型号：Quanta TM 450 FEG）
振动筛（Thermolyne，型号：M-16715）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：mySPIN TM 6，目录号：75004061）
烤箱（一般信号，型号：重力对流）
SEM样品安装支柱，铝开槽头（电子显微镜科学，目录号：75220）
Samdri 790临界点烘干机（Tousumis）
溅射涂布机（Denton Vacuum，型号：Desk V）

程序

扫描电子显微镜（SEM）和运动精子细胞结构：
成熟精子细胞的SEM检查使得快速可视化和比较整个配子结构与费力的TEM观察和细胞重建相比。成熟细胞中配子结构和鞭毛组织的多样性在SEM中很容易看出（图1）。

图1.植物精子细胞的扫描电子显微照片。：一种。 Pellia epiphylla ，一种简单的thalloid liverwort。这是苔藓植物产生的最长的精子细胞之一。两个鞭毛（f）在插入细胞前方交错交错（a），细胞体由长的圆柱形核（n）组成，后部具有质体和线粒体（箭头）。 B. conocephalum conicum ，一种复杂的thalloid hepwort。这个精子细胞比Pellia 小得多。两个鞭毛（f）前面（a）插入，并且比细胞体长得多，细胞体由圆柱形核（n）和后细胞质组成，在这种情况下，这不是完全延伸的。 Equ se ar。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。大约36个基底体（bb）沿着细胞的前线圈附着鞭毛（f）。核（n）延伸到细胞后（不可见）。镰刀菌（Ceratopteris richardii），一种叶片孢子蕨。该细胞四次缠绕，并且具有约80个鞭毛（f）前方插入（a）。圆柱形核（n）延伸三个线圈，并在细胞后方呈锥形。棒=5.0μm（A），1.0μm（B，C，D）。

使用切除的雄性组织（雄性配子体的吸虫），在0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）（见食谱）的每个液滴（100μl）中在牙蜡板上盖几个花药以延缓蒸发，并在室温下放置一夜，以促进精子的释放。或者，将切除的烟酰胺置于1.5ml Eppendorf离心管中，加入1ml 0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）以完全覆盖组织并放置过夜。第二天可以去除和丢弃炎症组织。游泳精子将在缓冲区。
取出组织，并将液滴放入含有1毫升2.5％戊二醛的1.5毫升Eppendorf离心管中（参见食谱）在0.05M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）中（见食谱）。
轻轻摇动管，并在室温下将精子悬浮液固定1 h 注意：从这一点上，通过在每个溶液变化之间以100×g离心5分钟浓缩精子。因为精子是无色的，离心后很可能看不到颗粒。
将戊二醛上清液除去至0.1ml，将颗粒置于管底部。在1ml 0.05M二甲胂酸钠缓冲液中漂洗固定的精子细胞三次（每次10分钟）
在1ml 2％四氧化锇水溶液中修复组织20分钟（参见食谱）
在1ml双蒸高压灭菌水（10分钟）中冲洗标本两次，每次25％，50％和75％乙醇（10分钟），100％乙醇（10分钟）中两次，然后在100％六甲基二disilizane（HMDS; 10分钟）
将1毫升HMDS中的精液细胞吸入固定在标准铝针式安装支架上的玻璃盖玻片上，并在60℃烘箱中干燥20分钟。
安装支柱上的样品被溅射涂覆有导电金属（钯 - 金）的超薄层（大约390nm），其阻止非导电生物样品的充电，增加了来自样品表面的二次电子改善了地形对比度，并最大限度地减少了对样品的损伤基本步骤：
1. 真空下溅射涂布机
2. 氩气气体
3. 施加电压
4. 开放气体到特定排放物
5. 大衣与大约 390nm钯金
查看高分辨率SEM。

注意：细胞通常聚集在盖玻片的边缘周围，因此最好将一小滴精子细胞悬浮液放在盖玻片中间的HMDS中干燥。

食谱

0.01M磷酸盐缓冲液（pH7.2）
加入5份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至95份双蒸高压灭菌水
0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）
加入25份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至75份双蒸压灭菌水
0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）
将1份0.20 M Sorenson磷酸盐缓冲液（pH 7.2）加入到9份双蒸压高压灭菌水中
2.5％戊二醛
1. 将1份10％戊二醛加入1份双蒸煮蒸压水中
2. 将1份0.20 M Sorensen磷酸盐缓冲液（pH 7.2）加入1份双蒸压蒸煮水中
3. 加入1份5％戊二醛至1份0.10M索伦森磷酸缓冲液（pH7.2）
0.05 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）
加入1份0.30 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）至5份双蒸煮蒸压水
2％四氧化锇水溶液
将1份4％四氧化锇水溶液加入1份双蒸精制高压灭菌水中

致谢

这项研究得到了国家科学基金资助的研究资助（DEB-0322664，DEB-0423625，DEB0521177和DEB-0228679）的支持，作为本科生研究经验和组装生命之树计划的一部分。

参考

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Lopez-Smith，R。和Renzaglia，K。（2008）。蕨类植物中的精子细胞结构，授精和受精，Cer藜richardii 。 Sex Plant Reprod 21：153-167。
Renzaglia，K.S.，Dengate，S.B.，Schmitt，S.J.，Duckett，J.G。（2002）。新的Phytol 154：159-174。

Renzaglia，K.S.Duff，R.J.T.，Nickrent，D.L。和Garbary，D.J。（2000）。早期土地植物的植物和生殖创新：对统一的系统发育的影响。 > Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355（1398）：769-793。

Renzaglia，K.S。和Garbary，D.J。（2001）。土地植物的动态男性配子：多样性，发展和进化。 Crit Rev Sci 20：107-213。

Renzaglia，K.S.，Johnson，T.H.，Gates，H.D。和Whittier，D.P。（2001）。 Psilotum 精子细胞的体系结构 Am J Bot 88（7）：1151-1163。

Renzaglia，K.S.，Rasch，E.M。和Pike，L.M。（1995）。苔藓植物精子细胞中核DNA含量的估计：系统学考虑 Am J Bot 82：18-25。

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