材料和试剂

1.5 ml微量离心管
移液头（10μl，200μl，1,000μl）（Genesee Scientific，目录号：24-121RL）
移液头（10μl，200μl，1,000μl）（Genesee Scientific，目录号：24-150RL）
移液管（10μl，200μl，1,000μl）（Genesee Scientific，目录号：24-165RL）
15 ml培养管
电穿孔比色皿，1mm间隙（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652089）
培养皿
来自Addgene的SJ_XTL219菌株（Addgene，目录号：86400）
超纯水
抗生素：
潮霉素（50mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，InvitrogenTM，目录号：10687010）
四环素（12.5mg / ml）（Sigma-Aldrich，目录号：T3383）
PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
Phusion高保真聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530L）
L（+）阿拉伯糖（EMD Millipore，Calbiochem，目录号：178680）
凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
胰蛋白胨（EMD Millipore，目录号：1.07213.1000）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625-1KG）
氯化钠（NaCl）（Fisher Bioreagents，目录号：BP3581）
LB琼脂（Fisher Bioreagents，目录号：BP1425）
Luria肉汤（LB）（见食谱）
LB琼脂平板（参见食谱）
蔗糖板（参见食谱）

设备

移液器（可以容纳2号以上的移液器吸头）
Milli-Q水净化系统（Millipore，目录号：Z00Q0V0WW）
高压灭菌器（AMSCO，型号：3041-S）
孵育器和振荡器（32°C和42°C）（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：Innova ^{® 3100，目录号：M1231-0000）}}
微量离心机（Eppendorf，目录号：5424）
电生理器（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652100）
凝胶电泳室（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704406）
热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：C1000 Touch ^{TM ，目录号：1851148）}
配有安道尔Neo sCMOS相机（尼康，型号：Neo 5.5，目录号：77026046）的尼康倒置显微镜Eclipse Ti-E（Nikon，型号：Eclipse Ti-E，目录号：MEA53100）

软件

尼康NIS-Elements高级研究软件

程序

设计sgRNA靶向您的感兴趣的基因。寡核苷酸被设计用于每个潜在的sgRNA序列，参见Li等人。（2016）。
组装oligo
一个。将同源性转移到SJ_XTL219（TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC）。
湾没有ngg的目标序列反转。
C。与SJ_XTL219（GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAG）的右侧同源臂。
订购完成了寡核苷酸合成公司的标准脱盐寡核苷酸。
将sgRNA重组为SJ_XTL219
1. 在32℃振荡器中在补充有潮霉素（75μg/ ml）的液体LB培养物（参见食谱）中生长SJ_XTL219 2.5-3小时，直至0.3至0.6之间的OD 600。重组质粒pSIM18具有温度敏感的复制起点，因此请确保将培养物保持在32°C。文化的数量取决于您正在执行的重组次数。我们建议每次反应5毫升培养基。参见Chan等人。（2007）获取更多信息。＆nbsp;
2. 在42℃振荡器中将培养物热冲击15分钟。这激活了已经在SJ_XTL219中的pSIM18中的λRED重组系统。＆nbsp;
3. 将培养物立即转移至冰水至少10分钟，冰水中3小时不会影响重组频率。
4. 使用具有Sorvall SA-600转子（或等效物）的冷藏式低速离心机，将培养物离心培养，以6,300 x g的速度在4℃下形成7分钟。＆nbsp;
5. 丢弃上清液。
6. 通过上下移动，用30毫升冷超纯水重悬沉淀。＆nbsp;
7. 使用带有Sorvall SA-600转子（或等效物）的冷藏式低速离心机，在4℃下再次离心6,300 x g 7分钟。
8. 通过倒置弃去上清液。＆nbsp;
9. 将沉淀重悬于1ml冷的超纯水中
10. 将细胞转移到1.5ml Eppendorf管中，并以最大速度30秒离心
11. 丢弃上清液。
12. 通过上下移动将细胞重悬在冷的超纯水中。对于每次电穿孔，需要50μl重悬细胞
13. 加入1μl您的oligo（10皮摩尔/μl）至50μl感受态细胞，并通过上下移液混合。
14. 将混合物转移到冷冻电穿孔试管中。将50μl感受态细胞等分成冷冻电穿孔试管，作为无寡核苷酸对照
15. 电穿孔。选择"细菌"设置。
16. 将1 ml的LB加入电穿孔试管，并用移液管与细胞混合以抽出细胞。
17. 转移至含有10ml室温LB肉汤的培养管中，并在32℃水浴摇床中摇动4小时。
18. 在32°C水浴中4小时后，将细胞培养物传播到蔗糖板上（见食谱）。
19. 将板放在32℃的培养箱中过夜。
检查菌落以通过菌落PCR成功插入
1. 使用底漆：
  1. 有意义的引文：TCCTGCGTCCTGGCGAAGAG
  2. 反义引物：CCATGACGAACCAGAACCAG
2. 正确的产品应为842 bp。
3. 通过使用上述检查PCR引物之一（我们使用测序服务）进行进一步确认的测序。
转录记者（作为一种监测感兴趣的基因被表达多少的方式）
1. 做一个具有荧光基因的菌株，其附近具有不是潮霉素的抗生素标记（Li等人，2016）。设计引物进行PCR这些元素。使引物的同源末端与感兴趣的基因之前的序列匹配。扩增荧光基因的引物必须具有Shine-Dalgarno序列（Li等人，2016）。我们可以提供一种菌株，其中氯霉素抗性基因位于msfGFP（SJ_XTL404）的下游（Li等人，2016）。＆nbsp;
2. 用您设计的引物PCR扩增菌株SJ_XTL404，并使用试剂盒从凝胶中纯化产物
3. 将荧光基因和药物标记PCR盒重组到CRISPRi菌株中，并在步骤5中确认
4. 重组后，在32℃超过2小时使细胞成长
5. 将细胞电镀在合适的抗生素平板上，在32℃的培养箱中生长过夜
6. 菌落PCR检查重组体。
诱导阿拉伯糖
1. 在LB过程中开始种子培养。
2. 在2ml目标培养基中稀释2μl过夜培养物（可以是LB或实验所需的任何培养基）。
3. 大约2小时（〜OD 600 = 0.1）后第一个背部稀释度达到指数期后，将5μl培养物回到955μl培养基，并在37℃下生长约3.5小时。我们建议使用这种背部稀释制备多个培养管来测试不同的阿拉伯糖浓度。＆nbsp;
4. 将10％阿拉伯糖加入您的背部稀释液中。你添加多少取决于你想要的向下表达式的级别。我们建议做一个梯度来测试什么样的浓度适合你。
5. 如果成像，修复您的细胞，当文化混浊。
使用tCRISPRi击倒基本和非必需基因的例子
我们提出了图1中tCRISPRi基因抑制的几个例子。它们是三个基本的基因rpoB，dnaG，和ftsZ ，三个非必需基因mCherry ， lexA 和 lacZ 。为了量化tCRISPRi的敲低水平，我们采用了一个msfGFP荧光转录报告系统。
对于这六个基因，我们观察到多达32倍的抑制，其中几个基因在2-3倍的抑制范围内。更具体地说，对于所有三个必需基因rpoB，dnaG ，ftsZ ，我们观察到基因表达高达14倍的敲低。这些基因的敲低导致细胞大小的显着增加（图1C）。对于非必需基因mCherry ，lexA 和，表达水平降低32倍，而且增长率和细胞大小受到击倒的影响（图1C）这些结果表明，tCRISPRi系统可用于从野生型水平的基本和非必需基因的基因表达分级抑制，最小的泄漏表达（图1）。

图1. tCRISPRi在基本和非必需基因中的应用 A.荧光转录报告基因的设计。 B.转录报告子的控制（msfGFP ）。 mCherry 是感兴趣的基因，其荧光水平与tCRISPRi敲除下的转录报告子（msfGFP ）相同，。（f基因组），，dnaG 和 rpoB （必需基因）和 lacZ / em>，mCherry （非必需基因）。所有6个基因的表达水平由tCRISPRi从野生型水平降低到26倍。三个基本基因的细胞长度都通过敲低而增加，而非必需基因的细胞长度保持不变

数据分析

使用配有Neo sCMOS相机（Andor）和Nikon NIS-Elements软件的Nikon Ti-E显微镜，以100倍放大倍率获得图像。对于细胞长度测量，使用相位对比技术，并且图像具有2,560×2,160分辨率和16位灰度。通过来自Coherent的OBIS 488nm激光和来自Chroma的59022过滤器立方体照明获得用于msfGFP细胞的荧光图像。对于每个细胞，荧光信号被整合并通过背景减去后的细胞的投影面积归一化。整个视野中的照明是同质的，少于5％的变化。对于每个实验条件，我们获取了150-200个包含至少10,000个细胞的图像，并计算了图1中数据的每个稳态群体的平均值。我们开发并使用为我们的实验优化的定制高通量图像分析软件使用Python和OpenCV库。有关数据分析的更多详细信息，请参见"材料与方法"以及"李等人"2016年的补充信息，具体列举了MreB，DnaA，RepA，SeqA在Si等中的淘汰。，2017年。

食谱

Luria肉汤（LB）400 ml
4克胰蛋白胨
2克酵母提取物
2克NaCl
加入超纯水至400 ml 高压灭菌器
在室温下存放
LB琼脂平板400 ml
4克胰蛋白胨
2克酵母提取物
2克NaCl
4.8克LB琼脂
加入超纯水至400 ml 高压灭菌器
倒入培养皿
完全冷却并保存在4°C
蔗糖盘800毫升
54克蔗糖完全溶解在水中
9克胰蛋白胨
4.5克酵母提取物
10.8克LB琼脂
加入超纯水800 ml 高压灭菌器
倒入培养皿
完全冷却并保存在4°C

致谢

我们感谢Don Court（NCI / NIH）与Li＆et al等人出版的作品合作。（2016）。这项工作得到了保罗•艾伦基金会，皮尤慈善信托基金，国家科学基金会职业资格奖和NIH R01 GM118565-01（至S.J.）的支持。我们感谢Sarah E. Cox对稿件的批判性阅读。

参考

Bikard，D.，Jiang，W.，Samai，P.，Hochschild，A.，Zhang，F.and Marraffini，L.A。（2013）。使用工程化CRISPR-Cas系统可编程性抑制和激活细菌基因表达。核酸研究中心41（15）：7429-7437。
Chan，W.，Costantino，N.，Li，R.，Lee，S.C.，Su，Q.，Melvin，D.，Court，D.L。和Liu，P。（2007）。基于重组的高通量条件敲除目标向量构建方法。 Nucleic Acids Res 35（8）：e64。
Li，X.T.，Jun，Y.，Erickstad，M.J.，Brown，S.D.，Parks，A.，Court，D.L。和Jun，S。（2016）。 tCRISPRi：可调和可逆的一步控制基因表达。 Sci Rep 6：39076.
Morgan-Kiss，R.M.，Wadler，C.and Cronan，J.E.，Jr.（2002）。使用大肠杆菌长期均质调控araBAD启动子的放射特异性的乳糖转运蛋白。 Proc Natl Acad Sci USA 99（11）：7373-7377。
Peters，JM，Colavin，A.，Shi，H.，Czarny，TL，Larson，MH，Wong，S.，Hawkins，JS，Lu，CH，Koo，BM，Marta，E.，Shiver，AL，Whitehead， EH，Weissman，JS，Brown，ED，Qi，LS，Huang，KC和Gross，CA（2016）。对基因基因进行全面的基于CRISPR的功能分析。 Cell 165（6）：1493-1506。
Si，F.，Li，D.，Cox，SE，Sauls，JT，Azizi，O.，Sou，C.，Schwartz，AB，Erickstad，MJ，Jun，Y.，Li，X.and Jun，（2017年）。大肠杆菌中起始质量和细胞大小可预测性的不变性 Curr Biol 27（9）：1278-1287。