材料和试剂

Scalpel刀片11号（Sigma-Aldrich，目录号：S2771）
双面胶带
带螺旋盖的玻璃闪烁瓶，体积为20ml（Sigma-Aldrich，目录号：Z190535）
移液器（BRAND，目录号：747760）或类似仪器
溅射涂层机的金环形靶（Agar科学，目录号：AGB7370）
橄榄（Olea europaea L.）芽
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
25％戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
乙醇绝对（Sigma-Aldrich，目录号：24102）
可选：技术级乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：V0T0042）
0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.2（磷酸钠缓冲液;参见食谱）
5％戊二醛溶液（0.1M磷酸缓冲液pH7.2;参见食谱）

设备

Scalpel手柄3号（Sigma-Aldrich，目录号：S2896）
镊子式＃5（Sigma-Aldrich，目录号：T4537）
临界点干燥器系统（BAL-TEC，型号：CPD 030）
立体显微镜（Olympus，型号：SZX12）
溅射涂布机（E510扫描电子显微镜涂布单元）（Polaron Instruments，型号：E510）
扫描电子显微镜（JEOL，型号：JSM-5410 LV）

程序

使用手术刀，将腋芽与射击分开。留下一个与茎连接的部分，用镊子夹住芽。垂直切割茎杆的相对侧，使您可以将样品放在芽边朝上（参见图1B）。
将5-10毫升（足以覆盖芽）的5％戊二醛溶液（见食谱）加入到闪烁瓶中。在室温下将芽浸入戊二醛溶液中24小时（固定溶液[Sabatini等人，1963];参见图1C）。
使用移液管从小瓶中除去戊二醛溶液。
通过向芽中加入磷酸盐缓冲液（参见食谱）清洗芽。 10分钟后，取出缓冲液。重复洗涤步骤5次。
加入25％乙醇溶液，悬浮1 h，取出溶液
加入50％乙醇溶液，悬浮1 h，取出溶液
加入75％乙醇溶液，悬浮1小时（断点）并除去溶液注意：如果需要，可以在该步骤（75％乙醇溶液）下暂停定影程序。芽可以在4℃过夜或几周内在75％乙醇溶液中储存。
加入95％乙醇溶液，悬浮1 h，取出溶液
加入100％乙醇溶液，悬浮1 h，取出溶液
加入100％乙醇溶液
根据制造商的说明，在临界点干燥器（CPD）仪器中干燥芽（干燥程序大约需要2小时）。
用镊子将茎干放在干茎上。使用立体显微镜，用手术刀或镊子小心地从芽中除去叶原基（Style＃5）。通常，除去4-5对叶原基后，分生组织暴露。
注意：这是一个关键的步骤，花时间轻轻地除去叶原基而不损害分生组织。
将一块双面胶带粘合到金属短截线上（短截线进入SEM;参见图1E和1F）。使用镊子将解剖的芽的茎片与金属菌根结合，暴露的分生组织面朝上（参见图1G）。
在溅射涂布仪器中，按照制造商的说明书，用金（Au）或金/钯（Au / Pd）涂覆样品（见图1H和1I）。
我们使用的涂层参数：真空0.02 Mbar，溅射电压2.4 KV，电流20 mA，涂布时间150秒。

图1.成像样本的准备。 A.橄榄枝的图片B.分离的芽样品，附有茎片; C.浸泡在闪烁瓶中的固定溶液中的芽样品; D.在CPD仪器中干燥后的干芽样品; E.用于SEM成像的金属短棒; F.带有一块双面胶带的金属短棒; G.安装在金属桩上的解剖干芽样品; H.用金覆盖的解剖干芽样品I.用金钯覆盖的解剖干芽样品。
将存根放置在扫描电镜中，并根据制造商的说明操作SEM，以生成分生组织的图像（见图2）。

图2.整个样品的SEM图像在高真空条件下在20 kV的加速电压下进行。 Bud于2011年2月23日采样。比例尺= 1 mm。

数据分析

裁剪图像以缩小图像中感兴趣区域的中心位置，确保保留精确的比例尺。使用您选择的软件从您生成的图像创建一个数字（请参见图3和图4中使用PowerPoint [Microsoft]创建的图形示例）。

图3.在巴尼亚橄榄中开花花序。在不同发育阶段显示橄榄花序的SEM图像。 2011年2月9日（A），2011年2月16日（B），2011年2月23日（C-E）和2010年2月7日（F））采集的侧芽产生图像。 A-C。花序发育的初期阶段顶端分生组织（Am）不会启动新的叶原基，扩大和膨胀（“圆顶”），随后成为末端花分生组织。围绕Am的侧花分生组织（Lm）开始膨胀。叶原基发育成苞片（Br）。 D-E。花序分生组织发育的后续阶段。顶端花分生组织（Am）发育成根尖花（Af）。侧花分生组织（Lm）分化为侧花（Lf）。 F.开花前花序。比例尺= 0.25 mm。

图4.橄榄花的开发。在不同发育阶段显示橄榄花的SEM图像。从2011年2月23日采集的巴尼亚橄榄侧芽最骄傲的图像。A.初始膨胀（“垄断”）和分生组织的扩大;分生组织的外围区分成花萼（Ca;萼片）; C-即随后，中心花分生组织发育成花冠（Co）和雄蕊（St），雌蕊未见。 F.花芽在开花前。刻度棒= 0.1 mm。

笔记

稀释的乙醇溶液可以由廉价的工业级乙醇制备（参见材料和试剂＃11）。
如苹果（Malus domestica，Borkh; Haberman等人，2016）和西番莲（西番莲）所示，该方案可以在其它植物物种中实现， Sims; Nave等人，2010）。

食谱

0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.2（1L）
1. 首先生产Na 2 HPO 4（二元）和NaH 2 PO 4（一元）的1M储备溶液，。
  在蒸馏的H 2 O 3中溶解141.96g的Na 2 HPO 4，并将最终体积完全溶解至1L。对119.98g NaH 2 PO 4
2. 将68.4ml 1M Na 2 HPO 4与31.6ml 1M NaH 2 PO 4混合并稀释最终体积为1L。得到1L 0.1M磷酸钠缓冲液pH7.2。
注意：如果您正在使用水合磷酸钠，请确保调整磷酸钠的用量以生产1M溶液。
磷酸盐缓冲液中的5％戊二醛溶液
根据其0.1M磷酸盐缓冲液（配方1）中的初始稀释度稀释戊二醛溶液。如果您使用25％戊二醛的储备溶液，最终体积为100ml，将20 ml 25％戊二醛溶液与80 ml磷酸盐缓冲液混合。
注意：戊二醛是有毒的和强烈的刺激性，总是戴着手套，在化学防护罩上工作，妥善处理。

致谢

方案中的固定方法是根据“电子显微镜固定”（Hayat，1981）所着的。

参考

Haberman，A.，Ackerman，M.，Crane，O.，Kelner，JJ，Costes，E.and Samach，A。（2016）。＆nbsp; 对苹果品种的各种果实负荷的不同开花反应与TFL1编码基因的转录本再累积程度相关。植物J 87（2）：161-173。

Haberman，A.，Bakhshian，O.，Cerezo-Medina，S.，Paltiel，J.，Adler，C.，Ben-Ari，G.，Mercado，JA，Pliego-Alfaro，F.，Lavee，S和Samach，A.（2017）。开花基因座T编码基因在解释影响橄榄的环境和内部提示中的可能作用（ Olea europaea L.）花诱导。植物细胞环境。

Hayat，M.A。（1981）。电子显微镜的固定。 a> 学术出版社。

Nave，N.，Katz，E.，Chayut，N.，Gazit，S。和Samach，A。（2010）。番茄果实中的花卉发育西番莲需要光周期诱发的系统性移植物传播信号。植物细胞环境33（12）：2065-2083。

Sabatini，D.D.，Bensch，K。和Barrnett，R.J。（1963）。细胞化学和电子显微镜。通过醛固定保存细胞超微结构和酶活性。细胞生物学17：19-58。